基于snp分型的荧光定量pcr检测粒细胞嵌合体的研究

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1、In西医科大学硕士学位论文基于SNP分型的荧光定量PCR检测粒细胞嵌合体的研究摘要目的：本研究旨在建立一种用于移植后特异性细胞嵌合体定量分析的新方法——基于SNP基因分型的实时荧光定量PCR技术，在兼顾监测方法的稳定性、高效性及经济性的基础上，提高嵌合体监测分析技术的特异性、精确性和灵敏度。为移植相关免疫学研究提供良好的实验手段，并初步探讨该技术在监测移植后嵌合状态中的应用。方法：筛选了分别来自于6条不同染色体的7个特异性SNP位点，合成相应的引物和探针；随机抽取10例无关健康人模拟供受者，用流式细胞仪分选出CDl5+

2、粒细胞，利用Cycling探针建立实时荧光定量PcR法，对模拟粒细胞嵌合体进行检测，用以评价本方案的可行性和准确性。最后分别对4例异基因造血干细胞病例移植后的外周血样进行嵌合率分析。结果：1．流式细胞分选技术分离粒细胞：用特异性荧光抗体CDl5+．FITC标记粒细胞，通过流式细胞仪分选出CDl5+粒细胞，分选细胞纯度>97％，回收率>96％。2．SNP位点选择：从dbSNP数据库中筛选了7个SNP位点，这7个sNP位点分布于不同染色体上，包括四种碱基替换类型，其中2个～G，2个C／T，2个刖C，1个C汜。在中国人群中基

3、因频率介于O．3～0．7之间。3．基于SNP分型的定量方法的建立：使用紫外分光光度计可准确测定样本DNA浓度。我们制作了rs2968位点A等位基因的标准曲线，阴阳性模板经实时PCR扩增后，输出标准曲线：)，=．3．783X+13．75，扩增效率为0．838，R2=o．999l。各个梯度浓度的平均Ct值显示：该标准曲线线性关系好，灵敏度不低于0．1％。4．临床标本分析：用流式细胞仪分选出4例样本CDl5+粒细胞，样本纯度达97％，提取基因组DNA，经实时荧光定量PCR检测，确定供受者基因型，并分别于移植后第7天(+7d)

4、、+14d、+28d、第2个月(+2m)、+3m时对移植后受者样本计算嵌合率。+28d粒细胞及外周血平均嵌合率分别为loo％和94．25％，同期外周血ANC>O．5×109／L，获造血重建。例2在+28d发生急性GVHD，同期粒细胞嵌合率仍处于100％，外周血嵌合率为90％；例4于移植后+2m时，粒细胞及外周血嵌合率分别下降了15％和5％，而在+3m时骨髓象复发，MRD为阳性，同期粒细胞及外周血嵌合率降低了35％和20％，但外周血象正常。结论：流式细胞分选术可以高效、快捷地分离出高纯度的目的细胞。实时荧光定量SNP—P

5、CR方法，是对异基因造血干细胞移植后嵌合体检测的更为有效的方法。关键词：造血干细胞移植：粒细胞嵌合体；单核苷酸多态性；Cycling探针；实时PCR；山西医科大学硕士学位论文QantitatiVeanalysisofgranulocytechime“smusingreaI—timePCRandsingIenucleotidepolymorphismsAbstractobjective：Toes鼬llishanovelpostItraIlSplantaLssayapproachforquantitatiVeassessn

6、lentofmixedhem纳Dpoieticctlimerismusingreal-timepolymerasechainreaction(PCR)ofsingIenucleotidepolymorphisms(SNPs)，thatcallimproVespecifici够aCcuracya11dsensitiVi够oftheteclllliques．WhichbaSedonstabili够，e伍ciencyaIldeconomy．TllenitproVideda900de)【perimentalmeansfIort

7、hetransplant-relatedimm珊olo西calgtndies锄dtoexploTe也etechnologyinthemonitoringofchime—smanertrallsplantationstateapplicatio船．Methods：Fortllepurposeofdevelopingancllimedsm柚aIysismethodforChinesepatien_cSwhichundenⅣentthehematopoieticstemcentr卸splantatio玑weSearChedm

8、edbSNPdatabaSearldgotsevensNPst0deVelopmentaninfo肌atiVepallel．Sortinggranulocyte(cDl5十)bynowcytometer．Es讪lishaSNP-b删qu枷tatiVemethoduSingr鼢l—thePC凡锄dmenaIlalySet、^，ocl