生物化学实验教案（养殖0713）-生物化学实验教案.pdf

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1、生物化学实验教案2008—2009学年度第一学期开课单位水产学院课程名称生物化学实验授课班级养殖0713任课教师韩芳试验一蛋白质显色反应和氨基酸纸层析（一）蛋白质的显色反应一、目的要求：1、理解蛋白质具有双缩脲反应。2、理解蛋白质和α--氨基酸均能与茚三酮作用产生有色化合物。3、了解氨基酸、蛋白质的某些侧链功能基团能发生黄色反应、米伦氏反应等显色反应。二、教学方法和教学学时：1、教学方法：学生操作实验，教师指导。2、教学学时：2学时。三、实验内容：蛋白质是由很多氨基酸通过特殊的结构而形成的，氨基酸以及这

2、些特殊的结构与化学试剂作用而产生颜色，称呈色反应。蛋白质的呈色反应非常灵敏，常用作检验蛋白质和某些氨基酸的反应，也是定量测定的依据。<一>、双缩脲反应：验证蛋白质具有双缩脲反应，能观察到蓝紫色的出现。l．取小量固体尿素，故在干燥小试管中，在弱火上加热，此时尿素溶融并放出氮，直到溶融物呈白色而坚硬的停止加热。2．冷却后，加入10％NaOH溶液1ml，摇匀溶解，再加入1％CuSO4溶液5滴，摇匀，观察颜色。3．取另一小试管，加入10％NaOH溶液1ml及1％CuSO4溶液5滴，后逐滴加入1％卵清蛋白溶液，观

3、察溶液颜色的变化。<二>、茚三酮反应：验证蛋白质能与茚三酮作用产生蓝紫色化合物。l．取干净滤纸一小片，滴上1％酪氨酸溶液1滴，酒精灯上小火烘干。2．冷却后加l～2滴0.1％茚三酮酒精溶液，待酒精蒸发后烘干(注意勿着火)，观察出现颜色。<三>、黄色蛋白反应:验证蛋白质的某些侧链功能基团能发生黄色反应（与浓HNO3反应）。l、取1％卵清蛋白lml于溶液中，加浓硝酸（3－5）滴，此时出现蛋白质沉淀（为什么？），小心加热，观察沉淀颜色的变化。2、用自来水冷却试管，逐渐滴人40％NaOH溶液使之成为碱性，观察沉淀

4、颜色的变化。四、作业：实验报告（二）氨基酸的纸层析法分离一、目的要求：1、掌握分配层析分离技术的原理。2、掌握用纸上分配层析法分析氨基酸的方法。二、教学方法和教学学时：1、教学方法：学生操作实验，教师指导。2、教学学时：2学时。三、实验内容：以滤纸及其结合水作为固定相，以有机溶剂（正丁醇：醋酸：乙醇：水=4：1：1：2）作为流动相，分离混合氨基酸样品，并鉴定其成分。四、结果与分析：用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的Rf值，与标

5、准氨基酸的Rf值对照，确定水解液中含有哪些氨基酸。（一）实验结果混合样品标准氨基酸亮氨谷氨酪氨组氨酸酸酸酸Rf成分计算公式：（二）分析结果：五、注意事项1．点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能达到的部分）。2．点样斑点不能太大（直径应小于0.3cm），防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。3．展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。六、思考题1．为什么点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面？2．影响物质移动速率Rf值的因素有哪些？七、作业：完成实验报告实验三

6、蛋白质的粗提及含量测定（考马斯亮蓝G-250法）一、目的要求：1、掌握蛋白质粗提方法。2、掌握考马斯亮蓝G－250法样品蛋白含量的原理。二、教学方法和教学学时：1、教学方法：学生操作实验，教师指导。2、教学学时：4学时。三、实验内容：1．蛋白质的粗提：2．样品中蛋白质含量的测定（1）标准曲线的制作取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。管号123456蛋白质标准液（ml）00.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250试剂（ml）555555蛋白质含量（

7、μg）020406080100盖上塞子，摇匀。放置2min后在595nm波长下比色测定（比色应在lh内完成）。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。（2）另取1支具塞试管，准确加入0.1ml样品提取液，再加入0.9ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595nm波长下比色，记录吸光度。四、结果处理根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：查得的蛋白质含量（µg）×提取液总体积

8、（ml）样品蛋白质含量（µg/g鲜重）=样品鲜重（g）×测定时取用提取液体积（ml）五、注意事项比色应在出现蓝色2min～lh内完成。六、思考题1．常用蛋白质的提取方法有哪些？各有何优缺点？2．考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？3．如何正确使用分光光度计？七、作业：完成实验报告。实验四还原糖和总糖含量的测定（3，5-二硝基水杨酸比色法）一、目的要求：1、掌握用硝基水杨酸比色法测定样品中总糖和还原糖含量。