肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）的底物制备及酶学特性研究-论文.pdf

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1、广东农业科学2012年第1O期l31肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)的底物制备及酶学特性研究刘少莉，王冬冬，韩伯涛，陈雪梅，盖颖(北京林业大学生物科学与技术学院／国家林业局树木花卉育种生物工程重点实验室，林木育种国家工程实验室．北京100083)摘要：采用原核表达体系和HPLC法，分别获得肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)及其反应底物——香豆酰CoA酯，并对CCR酶学特性进行研究分析。结果表明，通过酶学方法和HPLC的分离纯化能够得到较高浓度和纯度的CCR反应底物；重组毛白杨CCR的最适反应温度是37％，最适pH值为6．25，K值为5．664~mol／L，V一为4．09nmol

2、／Ls。关键词：肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)；香豆酰CoA酯；酶学特性中圈分类号：Q554文献标识码：A文章编号：1004—874X(2012)10-0131-03Substratepreparationandenzymaticpropertiesofcinnamoyl-CoAreductase(CCR)LIUShao-li，WANGDong-dong，HANBo-tao，CHENXue-mei，GAIYing(CollegeofBiologicalSciencesandBiotechnology,BeringForestryUniversity／TreeandOrn

3、amentalPlantBreedingandBiotechnologyLaboratoryofStateForestryAdministrative／NationalEngineeringLaboratoryofForestTreeBreeding,Bering100083，China)Abstract：Cinnamonyl—CoAreductase(CCR)andtheirreactionsubstrateswereobtainedbyaprokaryoticexpressionsystemandHPLC．Thentheenzymaticprope~iesofCC

4、Rwereresearchedandanalyzed．Theresultsshowedthatp-coumaroy

5、-CoApurifiedwasavailablefortheactivityofCCR．TheoptimumtemperatureoftherecombinantCCRwas37，theoptimumpHwas6．25，theKwas5．664Ixmol／LandV—was4．098nmol／Ls．Keywords：cinnamonyl—CoAreductase(CCR)；p-coumaroyl-CoA；enzymaticprope~ies木质素是存在于

6、植物纤维中的一种芳香族高分子化(SUKUN，SKY一2102C)、超声波细胞粉碎仪(JY92一II型超合物，在植物的系统进化、人类的物质生活和植物的生长声波细胞粉碎机)、超净工作台(ZHICHENG，ZHJH一发育等方面具有重要作用_1]。相关研究表明，肉桂酰辅1109B)、Bio—RadMiniSDS～PAGE蛋白电泳槽及电泳仪、酶A还原酶(cinnamonyl—CoAreductase，CCR)是木质素一70℃超低温冰箱(LG，GR一213PVQL)、紫外一可见分光光合成途径中的第1个限速酶_3_。近年来，国内外学者对多度计(ThermoSpectronic，He

7、lios)、高速冷冻离心机种植物CCR的提取【4_、基因克隆[6_’]及转基因[8-9]进行了(HITACHISCR20BC)、HPLC-MS(Thermo，LCQDECAXP广泛深入的研究，而对CCR进行酶学特性分析报道较MAX)等。少。我们通过生物合成的方法制备得到CCR反应底1．2试验方法物——香豆酰CoA酯．进而对CCR的酶学特性进行了初1．2．1香豆酰CoA酯的制备与分离纯化在木质素合成步研究途径中，香豆酸经4CL1催化得到的产物香豆酰CoA酯即是CCR酶学反应的底物，因此香豆酰CoA酯的制备方法l材料与方法采用4CL1酶学反应法。4CL1反应体系如下：0．

8、2mol／L1．1试验材料Tris～HC1缓冲液(pH值7．8)，5mmol／LATP，0．3mmol／L重组毛白杨4CL1菌株(pQE31—4CL1／M15)、重组毛CoA，0．4mmol／L香豆酸。在反应体系中加入过量4CL1，使白杨CCR菌株(pQE31一CCR／M15)均由北京林业大学提底物充分反应在37℃下反应过夜。供。香豆酸、辅酶A、ATPNa，NADPH均购自Sigma公司．将上述反应混合物在沸水中加热10min，使4CL1Ni—NTAagrose购自Qiagen公司，其余试剂为国产分析失活。13000r／min离心15rain，弃沉淀