基于重组工程法高转化效率的大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株构建-论文.pdf

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1、安徽农业科学，JournalofAnhuiA．Sci．2015，43(20)：29—31，72责任编辑李占东责任校对李岩基于重组工程法高转化效率的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株构建张飞飞，石牡丹，尚广东(1．徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室，江苏徐卅I22l004；2．江苏省微生物工程技术研究中心，江苏省微生物与功能基因组学重点实验室，南京师范大学生命科学学院，江苏南京210023)摘要[目的]提高最常用的异源蛋白表达宿主菌EcoliBL21(DE3)的转化效率。[方法]利用基于质粒的重组工程系统和双链断裂修复功能。[结果]敲除了编码降解外源DNA的I型限制性内切酶的积基因，

2、获得了高转化效率以及其他功能与BL21(DE3)仍保持一致的151928菌株。[结论]获得的151928菌株可能会作为获得催化用酶的关键材料，进而在蛋白质工程等研究领域有着重要的作用。关键词重组工程；基因敲除；双链断裂修复；大肠杆茵BL21(DE3)中图分类号S188文献标识码A文章编号0517—6611(2015)20—029—03ConstructionofHigherConversionEficiencyEscherichiacoliBL21(DE3)viaRecombineeringZHANGFei-fei，SHIMu·dan‘，SHANGGuang-dong“(1．Ji

3、angsuProvinceKeyLaboratoryofAnesthesiology，XuzhouMedicalCol·lege，Xuzhou，Jiangsu221004；2．JiangsuEngineeringandTechnologyResearchCenterforMicrobiology，JiangsuKeyLaboratoryforMicrobesandFunctionalGenomies，CollegeofLifeSciences，NanjingNorlnalUniversity，Naniing，Jiangsu210023)Abstract『ObiectivelThe

4、aimwastoimprovetheconversioneficiencyofthemostcommonlyusedheterologousproteinexpressionhoststrain．[MethodlTypeIrestrictionendonucleasecapableofdegradingexogenousDNAcodinggenehsdRwasknockedoutviaplasmid。basedreeombineeringsystemaswellasitsinherentdoublestrandbreakrepair(DSBR)function．【Resuh1T}

5、leobtainedstrainLS1928wasstillCOI1．sistentwithE．coliBL21(DE3)ineveryaspectexcepthigherconversionefficiency．1Conclusion『Thenewlydevelopedstrainhasthepotentialtobeusedaskeymaterialtoobtaincatalyticenzymeandhenceplaysanimportantroleinproteinengineering．KeywordsRecombineering；Geneknockout；DSBR；E．

6、coliBL21(DE3)酶是工业化生产的关键材料，也是现代绿色经济和工业6e￡和gain基因。Exo蛋白是一种5一3DNA外切酶，结生物技术的基础。野生型的酶常常难以具有人们所期望的合在双链DNA的末端得到3端突出的DNA分子；Bet蛋最佳活性。高催化活性以及高催化专一性酶的获得常常依白结合在突出的单链DNA分子上防止单链DNA被宿主赖于基因突变，由于突变的随机性，目标突变只占最终突变单链核酸酶降解，同时还具有介导互补单链DNA退火；Gam的极小比例，一般在百万分之一的级别，因此高转化效率的蛋白可与RecBCD结合抑制其降解DNA的活性。菌株是获得高覆盖率蛋白突变体库的基础之一

7、。突变体库BL21(DE3)基因组上hsdR基因编码I型限制性内切酶，也是研究基因或蛋白结构和功能的关键手段。在大肠杆菌细胞中起到一种“抗体”的作用，对外来的DNA常规的得到蛋白突变体的试验步骤是将通过特定方法有严格的限制。hsdR基因的变异或缺失会导致菌株细胞内(如DNAshuffling和易错PCR)所获得的突变体基因库的I型限制性内切酶活性缺失，这对外来基因的导入及质粒以限制性内切酶进行酶切后所得的DNA片段和同样酶切的转化是有利的。笔者通过利用重组工程的方法将Ecoli载