产琥珀酸大肠杆菌工程菌株的构建

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1、万方数据研究报告中国酿造2010年第2期总第215期·25·产琥珀酸大肠杆菌工程菌株的构建岳方方，姜岷木，马江锋，于丽，刘树文，韦萍(南京工业大学生物与制药工程学院材料化学工程国家重点实验室，江苏南京210009)摘要：大肠杆菌在厌氧条件及不额外添加电r受体的条件下可利用葡萄糖进行混合酸发酵，主要产物为甲酸、乙酸和乙醇，丁-二酸及乳酸含最较低。为减少副产物的生成，使更多的代谢流流向丁二酸，本研究拟失活厌氧条件下甲酸、乙酸及乳酸主要生成途径相关的酶(乳酸脱氢酶和丙酮酸甲酸裂解酶)。借助Red重组系统和位点特异性重组技术，无痕敲除了野生大肠杆菌W3110染色体上编码2个酶的基因p蜊ldh，构

2、建了1株pf珠lJdh双突变重组菌JMl307(Apfl△脚，并引AJ'YC前后对比实验表明：JMl307(pTrc99a-pyc)较出发菌株解除了生长抑制，在89，L初糖条件F，发酵48h，菌体密度可提高至OD。02．5，产物丰要为丁二酸(2．8g／L)，乙酸含量很低，无甲酸、乳酸牛成。关键词：大肠杆菌；琥珀酸：丙酮酸羧化酶；RED重组：无痕敲除中图分类号：Q786文献标识码：A文章编号：0254—5071(2010)02—0025—04ConstructionofengineeredEscherichiaco／JforsuceinateproducitionYUEFangfang，J

3、IANGMin+，MAJiangfeng，YULi，LIUShuwen，WEIPmg(StateKeyLaboratoryofMatcdals-O[JentcdChemicalEngineering,CollegeofBJotechnologyandPharmaceu6calEngineenng,NanjingUniversi(yofTechnology,Nanjin9210009,China)Abstract：Underanaerobicconditionsandintheabsenceofexogenouselectronaceeptors，Escherichiacolifermen

4、tsglucosetoamixtureofproductsconsistingofacetate，formateandethanol，aswellasasmallamountsoflaerateandsuccinatc．InordertoreducetheCO·productslactateandformate，aIdhpndoublemutanthasbeenconstructedbasedontheREDrecombinationsystemandthesite—specificrecombinanttechnology．Thefermentationresultsindicated

5、thatdeficientinbothofthetwoenzymesshowedsignificantgrowthdefectsbecauseofpyruvateaccumulationwhichwouldnegativelyaffectthephosphoenolpyruvate—dependentsugartransport．SinceE．col／lackstheanapleroticenzymepyruvatecarboxylase．pyruvateaccumulationandsuccinateformationinthisstraincouldbealteredbydirect

6、ingpyruvatetothesuccinatebranchwiththisenzyme．Hence，arecombinantplasmidpTrc99a-pycwasconstructedandtransformedtoJMl307．Resultsshowed：with8g／LinitialglUCOse，thecelldensityofJMI307(pTrc99a-pyc)enhancedtooD；∞2．5，andthemainproductwassuccinate(2．8∥L)withlittleaceticacid，andnoformicacidandlacticacidwer

7、eproduced．Keywords：EscherichiaCO北succinate；pyruvatecarboxylase；REDrecombinationsystem；knockoutwithnomark琥珀酸(又称丁二酸)作为‘种C4平台化合物，口J．被广泛用于医药产品、精细化工产品以及可生物降解的聚合物的前体。传统生产方法采用的是从丁烷经顺酐通过电解生产，生产污染大、成本高，严重抑制了琥珀酸的发展潜力。生物法制备琥珀酸以可再