利用木糖产琥珀酸重组大肠杆菌的构建

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1、文献综述1.1前言近年来，随着分子生物学和基因组学的飞速发展，生物催化技术不断成熟，已越来越多的应于工业合成领域，辅因子代谢工程的研究也逐渐得到研究者们的关注。但由于生物催化过程中很多酶（如脱氢酶等），要具有生物活性必须与辅因子结合，因此辅因子的旮效供给对于这类酶催化的生物反应过程至关重要。辅因子代谢工程主要是通过基因工程、代谢调控等方法调控生物反应中涉及的辅酶（或辅因子）及其参与的过程，从而影响代谢网络［11。代谢工程的研宂主要集中在对某些代谢途径酶水平的放大、添加或失活的操纵。对于进一步提高系统的生产效率，辅酶的调控尤为重要。辅因子通常是作为电子，原

2、子或某些化学基因的载体。S前对于辅酶还没有彻底系统的研究，但辅酶调控为代谢工程的研究提供了一种新的思路。近年来一些学者发现辅酶还原态与氧化态的比值常常与生物存在外部环境的氧化还原态势有极大的关联，所以通过调节反应环境的氧化还原态势、pH等提高生物氧化还原反应过程中辅酶的有效供给进而对菌体生长和代谢流向进行调节控制。在微生物活细胞屮，参与生物氧化反应的脱氢酶的辅酶本身不能跨过膜，被局限在其所在的细胞空间内。它们必须被再生，才能冋用，以维持能量代谢。脱氢酶的辅酶在细胞的氧化还原反应中接受电子而被还原成还原型辅酶，还原型辅酶把电子释放给电子受体，从而实现脱氢酶

3、的辅酶的再生。辅酶的有效供给是氧化还原酶类生物催化反应在工业化应用中的关键，而辅酶的价格相对贵，其稳定性较低，从技术经济角度出发考虑，在生物催化过程屮添加人量的辅酶是不可取的，而探索幵发高效、低成本的辅酶系统再生体系是生物催化与生物转化技术在工业化应用中的关键技术。1.2有关辅酶系统的研宄1.2.1NADH和NAD+在生物体中的重要性在酶的六大类型中，30%〜35%为氧化还原酶。氧化还原酶催化反应在应用于手性合成、制药、食品添加剂等方面具有明显的优势，其应用越来越受到研究者们重视。而在氧化还原酶所催化的反应中，合成产物的同吋会消耗一定量的辅酶，约80%的

4、反应需要尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，NADH）作为辅酶，10%的反应以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP,NADPH)为辅酶，只有很少一部分以黄素(FMN，FAD)和辅酶Q(PQQ)为辅酶［2］。NAD+(NicotinamideAdenineDinucleotide,烟醜胺腺曝咚二核苷酸)和其还原形式NADH(NicotinamideAdenineDinucleotideHydrogen,烟醜胺腺卩票吟二核苛酸)是生物代谢过程中一类重要的氧化还原辅酶。NAD1•的基木生理功能是维持细胞的生忪、分化和能量的代谢；NAD(H)在生物体内的糖酵解、拧檬

5、酸循环和光合作用等过程中，起着电子传递的重耍作用［34］。NAD+和NADH参与的多酶氧化还原体系是生物体细胞呼吸链中电子传递过程的主要生物氧化体系，糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解屮的氧化反应绝大部分也都是通过这一体系完成的。细胞内NADH/NAD+的水平与细胞所处环境的氧化还原状态息息相关，在许多发酵体系中经常采用调节氧化还原状态的办法来实现对菌体生长和代谢的改变［5］。1.2.2调控大肠杆菌中关键酶活的研究NAD(H)作为辅酶参与了300多种氧化还原反应，并且参与调控多种酶活和基因过程，NADH/NAD1的水平对微生物分解代谢兵有重要的影响。细胞的生

6、长需耍充足的NAD+来进行氧化，以葡萄糖为碳源进行发酵考察。菌株由于敲除了丙酮酸甲酸裂解酶某因冰和乳酸脱氢酶棊因W/7,使其成为生产琥珀酸的潜力菌株，然而，两基因的失活致使NADH不能及时再生为NAD+,引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡，最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖代谢生长l6j。过量表达了苹果酸酶(ME)，使丙酮酸生成苹果酸，进一步生成琥珀酸。该反应过程中，不仅有利于缓解丙酮酸的积累，而且能使多余的NADH生成NAD+，降低NADH/NAD+的比例，恢复了菌株在厌氧条件下的生长和产酸能力［7"8］。过量表达了苹果酸脱氢酶(MDH)使草酰乙酸生成

7、苹果酸，进一步生成琥珀酸。该过程也能使更多的NADH生成NAD+,缓解辅酶系统的平衡，恢复了菌株的生长和产酸能力l9j。Goldberg等和Wang等曾研究过在大肠杆菌中过量表达延胡索酸还原酶(FUM),使延胡索酸生成琥珀酸，还伴随着NADH向NAD1的转化，恢复了菌株的生长能力，生成更多的琥珀酸。1.2.3改造在NAD(H)合成途径的研宄进展采用过量表达辅酶NAD(H)合成途径中关键酶的方法，改造NAD(H)生物合成途径，调控NADH/NAD+比例来提高辅酶NAD(H)的生成，从而进一步提高琥珀酸的产量，已越来越吸引研宂荠们的眼球。大肠杆菌中NAD(H

8、)合成途径如图1-1所示。Susana112］等通过在人肠杆菌屮过景表达鼠伤寒沙