致肾盂肾炎大肠杆菌132菌株消减文库的构建及筛选

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1、中文摘要中文摘要目的：构建国内分离的致肾盂肾炎大肠杆菌(uropathogenicE．coli，UPEC)132基因组DNA消减文库，筛选其特异性片段，并对新发现的片段获取其完整的开放读码框(openreadingframe，ORF)．方法：t．以UPECl32为t伪t盯(待富集特有序列的菌株)，以完成基因组测序的非致病性E．coliK-12MGl655为driver(扣除t豁ter中共有序列的菌株)，应用抑制消减杂交(suppressionsubtraetivehybridization,SSH)技术，经过两轮消减杂交和两次抑制性PCR，选取UPECl32基因组的

2、差异片段，进行T-A克隆，转化给E．coliToplO，在氨苄青霉素(Amp)及X-gavlzro筛选下，挑取白色阳性重组子，获得UPECl32基因组DNA消减文库。2．从上述DNA消减文库中随机挑选阳性重组子，经碱裂解法提取质粒DNA作为模板，经PCR筛选验证．将上述PCR产物变性后点于尼龙膜上，地高辛随机引物法分别标记UPECl32和E．coliK-12MGl655基因组DNA作为探针，经过预杂交、杂交、DAB显色，筛选带有UPECl32特异性片段的阳性克隆子。挑选有意义的克隆株进行序列分析，所得序列结果输入GenBank，利用BLAST程序(http：／／ww

3、w／ncbi．nlm．gov／BLASTN)查找NCBI数据库，进行相似性比对．3．选取新发现的片段，用基因组步移(GcnomeWalker)方法获得其5’端和3’端的序列．首先提取UPECl32基因组DNA，将其分为4组，分别用DraI、EcoRV、StuI、PvUII酶切，然后与GenomeWalker接头(adaptor)连接，建立GcnomeWalker文库．分别以4组GenomeWalker文库基因组DNA片段为模板，以接头特异性引物和新发现片段的特异性引物进行第一次LD．PCR和第二次巢式PCR，将第二次PCR产物直接进行T-A克隆，转化给E．coliT

4、opl0，其结果用Proscan(Version1．7)软件分析，确定新发现片段中文摘要的完整ORF。结果：1．应用抑制性消减杂交获得约1600个重组子的UPECl32基因组DNA消减文库。，2．随机挑取其中的350个克隆，经PCR和斑点杂交筛选，挑选93个克隆测序，经生物信息学分析显示：1个UPECl32特异性SSH片段R049(789bp)与GenBank注册的UPEC菌株相关序列无相似性；39个UPECl32特异性SSH片段与GenBank注册的UPECl32菌株相关序列显示高度的相似性，其中10个为与致病相关基因序列，8个为与代谢与物质转运相关基因序列，2个

5、为与外膜蛋白有关基因序列，3个为与调节相关基因序列，还有11个为未知功能蛋白的基因和5个其它功能未分类的基因序列。另有19个UPECl32特异性SSH片段与GenBank注册的非UPEC菌株相关序列显示高度的相似性，其中13个与其他大肠杆菌tRNA或质粒序列相关，其他6个与沙门氏菌或志贺氏菌等的序列相关．此外，有lO个SSH片段重复出现，6个片段为使用的克隆载体(pMD．18T载体)的序列。所获得的UPECl32特异性SSH片段均未发现与E．coliK-12MGl655相关的序列，表明我们获得的UPECl32基因组消减文库是成功的。将新发现的UPECl32片段，命名

6、为R049(789bp)，提交GenBank注册，注册号为EF488001．3．以R049(789bp)为核心，用基因组步移技术双向延伸，获得R049(789bp)5’端1502bp和3’端1207bp。利用DNAStar5．01软件进行序列拼接，共获得3498bp的片段，进一步利用Proscan(Version1．7)软件分析，获得一个1311bp的可能的ORF，暂命名为R049(1311bp)。结论：本研究已成功地构建了UPECl32菌株基因组DNA消减文库。并获取了UPEC132的特异性片段，为致肾盂肾炎大肠杆菌致病机理的深入研究奠定了良好的基础。Ⅱ中文摘要关

7、键词：致肾盂肾炎大肠杆菌；抑制性消减杂交；特异性SSH片段；斑点杂交；基因组步移Ill英文摘要AbstractObjective：Toconstructandsa陀龃genomicDNAlibraryofuropathogenieE．coli132(UPEC132)bysuppressionsubtractivehybridization(SSH)．ToidentifythestrainspecificDNAsequencesfromDNAlibraryofuropathogenicE．coli132andfurthel"toobtaintheopenreadi