干旱胁迫下甘蓝型油菜消减文库的构建及分析

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1、华中农业大学硕士学位论文干旱胁迫下甘蓝型油菜消减文库的构建及分析姓名：刘春晴申请学位级别：硕士专业：作物遗传育种指导教师：涂金星；张学昆201206干旱胁迫下甘蓝型油菜消减文库的构建及分析摘要干旱是非生物胁迫中对农作物生长和产量影响最大的胁迫之一。世界范围内，每年由于干旱胁迫造成的损失相当于其他所有环境因子造成的总和。油菜干旱灾害是我国和其他主产国家经常性的自然灾害，中度干旱可导致油菜单产降低20％以上，严重时甚至绝收。我们前期研究发现，油菜耐旱品种在干旱胁迫下生长发育和产量相对稳定，基于分子生物学方法考察其在干旱胁迫条件下的应答机制，将有益于探究其抗旱分子机理，全面理解

2、抗旱性遗传基础，对于抗旱新品种培育和抗旱栽培技术研发具实践价值。本研究以甘蓝型油菜抗旱品系Q2为材料，用模拟干旱方式诱导基因表达，采用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了富含甘蓝型油菜Q2根和叶片抗旱相关基因片断的差减文库。应用反向Northern杂交技术对文库进行了筛选，并选取了三个阳性克隆进行了Real-timePCR验证。对选取的186个阳性克隆进行测序，同源检索结果显示，有156个片段能找到与之同源性高的基因。基因功能分类显示，所占比例分别为：l：代谢相关11．1％；3：催化及抗氧化活性10．9％；4：信号转导：lO％；5：转录调控6．4％；6：转运相关3．8％；7

3、：翻译调控：2％；8：蛋白质降解1．3％；9：抗性相关：1％；10：能量代谢1％；11：未分类36．4％；12：功能未知16．1％。就ESTs来源来看，绝大部分来源于拟南芥、甘蓝型油菜、甘蓝、大白菜、百合等植物。其中，功能分析结果发现已知功能的ESTs156条主要参与干旱胁迫应答的光合作用及叶绿体结构建成、抗性及防御、膜和转运类、转录相关功能以及信号转导。获得与抗旱密切相关的捕光叶绿素A／B结合蛋白、1，5．二磷酸核酮糖羧化酶、过氧化物酶、磷脂酰肌醇转运蛋白、ABC转运子、转录因子、丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶、GTP结合蛋白等重要基因的ESTs。这些ESTs基本上反映了干旱胁

4、迫下甘蓝型油菜基因的表达谱。对文库中获得的两个基因B、C(与过氧化物酶同源性很高)及一个未知功能ESTsA基因利用反转录PCR技术分析其表达情况。发现A、B、C在干旱胁迫后不同时间点的表达量差异较大，但三者的最高表达均发生在干旱胁迫后12h。进一步利用荧光定量PCR技术对反转录PCR结果中的3条差异表达ESTs进行精确定量。计算结果表明，3条ESTs的表达量在干旱胁迫后呈波动性变化，并且在基因表达过程中，华中农业大学2012届硕士学位论文三个基因分别在3小时有个降低的趋势，而在12小时后，功能基因得到大量表达，24小时达到高峰。说明干旱胁迫后12．24h是甘蓝型油菜表现抗

5、旱性的关键时间点。关键词：甘蓝型油菜，抗旱，抑制性消减杂交(SSH)，反向Northern杂交II干旱胁迫下1中蓝型油菜消减文库的构建及分析AbstractDroughtisoneofthemostimportantabioticstressesthatdicreasesplantgrowthandcropproductivity．Theannuallossinyieldcausedbydroughtstressisequivalenttothesumofallotherenvironmentalstressescausedworldwide．Asanimportanto

6、ilcrops，oneofthefivepreponderantcrops，oilseedannualproductionlossesmorethan20％causedbydrought，evenreaching25％一32％sometimesundersevereconditions．Itiscriticaltostudythedrought—responsivemechanismatthemolecularlevelSOastoimprovedroughtresistanceinrapeseedusingbioteclmiques．Toexplorethemechan

7、ismsofdroughtstress，acDNAlibrary,whichwerefromthehightolerantvarietiyQ2inBrassicanapus，wereconstructedusingsuppressionsubtractivehybridization(SSH)．Byreversenorthemhybridization,therewere186positiveclonesselected．ThreeofthemwererandomlyselectedforfurthertestingbyRea