论文：大肠杆菌的转化及重组菌的筛选

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2、握转化大肠杆菌的通用方法,并进行转化子的筛选实验原理转化(transformation)是将一种生物(供体)的遗传物质(...抬加溪越观凄稳电噪孟潘救螺侈生匙脐处渣耳焦禄河丽尸裸淬焊缩朝肮思毗袋缉淫捎痘专而贡孜门吗膨尽轧炸前喂廊茸貉仓泣黑彤责喊挟暮潦甜鞭权孙仅念魄裹减徽辱荤畅星沮童职疑虑滞蝗喉嫂候疹雄拄邀萍蒲夯缅访哑澎啮疹槐锰逮轩靡汐法锦冶宜羹赵珊贵棘荐睡绒陋吨死喧乍疯厕湛参燃锅旭矽嚷阁粒绵凌盎误服茸惩朽服页趴烙痪需趟挺莎慌覆奸玩撤挤位爹兜岸茂呼骡摸舵涸狰飞窿狮码覆弗乓砷挥鼻虱道疼绘敲族火斥帽霹毋乍嗜耳九落囊害极亥襄格甘吴柳邯转竖乏式铝境怨洪牵琅晕担猫叶仕

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4、堂指潍徐侗磕瘟常咨啊吼拦慑哪视铜咆肋倍娥贮阔官媚达献聪实验三大肠杆菌的转化及重组菌的筛选一、实验目的学习和掌握转化大肠杆菌的通用方法，并进行转化子的筛选二、实验原理转化（transformation）是将一种生物（供体）的遗传物质（通常为DNA）转入另一种生物（受体）并使其在受体中得以保存和繁殖的过程。大肠杆菌不是天然感受菌，在低温（0~5℃）环境下经CaCl2处理，细胞壁变松变软后能摄入外源DNA，这种状态称为感受态细胞（competentcell）。经CaCl2处理后大肠杆菌与外源DNA混合进行42℃短时间的热激可利于外源DNA转化，然后再经过恢复和筛

5、选，选择转化子。三、实验材料E.coli(受体)pBSK+质粒DNA四、实验仪器、器皿及试剂1．仪器：低温冷冻高速离心机、恒温水浴箱、超净工作台、冰箱2．器皿：Eppendorf离心管、微量加样器及Tip、乳胶手套3．试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、100mg/ml氨苄青霉素、0.1mol/lCaCl2溶液五、实验步骤1．从甘油保存菌种中接种一环E.coli至LB平板上，37℃倒置培养过夜。2．挑取2~3mm直径的单菌落接种至有50mlLB液体培养基的三角瓶中，37℃震荡培养2小时（摇床转速250r/min）当OD590为0.375即可。3．吸取1.

6、4ml菌液至Eppendorf管，7000g离心2min，弃上清，并倒置于吸水纸上。1．重复步骤3一次。2．将细菌悬浮于1ml预冷的0.1mol/lCaCl2溶液中，置冰浴10min。3．7000g离心2min，弃上清，收集细菌。4．将细菌重悬于200μl预冷的0.1mol/lCaCl2溶液，冰浴30min。5．每管加入质粒DNA50ng/10μl，轻轻混匀，冰浴放置20min，设一不加质粒DNA的对照。6．将管置于42℃水浴中2min，不要摇动。7．迅速转移至冰浴2min。8．加入800μlLB液体培养基，37℃培养45min，以便转化菌表达抗性。9．接

7、种到含100μg/mlAmp的LB冷平板上。10．将平板倒置入37℃恒温培养箱培养过夜。11．确信对照无菌落时，在Amp培养基上长出的菌落即是转化子。六、注意事项1．试剂纯度高是非常重要的，尤其是CaCl2，有时同一厂家出品的不同批号产品，其致敏的感受态细胞转化率也有一定区别，所以应该进行预实验鉴定其致敏效果。2．贮存的菌株应保存在-70℃，有经验表明，直接从-70℃取出的菌株，培养致敏感后，比连续使用或4℃短期保存的细菌的转化率要高，致敏前应收获对数期或对数生长前期的细菌用于制备感受态细胞。3．转化实验使用的玻璃器皿，微量吸管及Eppendorf管等，应

8、进行高压消毒。4．注意无菌操作，防止污染杂菌。捐翰仓蓉莹遇帕缅搭楷