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1、第28卷第2期成都大学学报(自然科学版)Vol.28No.22009年6月JournalofChengduUniversity(NaturalScienceEdition)Jun.2009文章编号:1004-5422(2009)02-0091-04分光光度法测定Fenton反应产生的羟基自由基颜军,苟小军,邹全付,纪小明,崔秀英,兰海蓉,李雪(成都大学中药化学实验室,四川成都610106)摘要:基于水杨酸可以捕获羟基自由基(·OH)生成2,3-二羟基苯甲酸和2,5-二羟基苯甲酸,在波长510nm处有最大吸收的原理,建立一种用分光光度法检测Fenton反应产生的羟基自由基(·OH)的方法
2、.通过对反应体系影响条件的优化,筛选出最佳反应物配比和最佳实验条件,并对其稳定性进行检测.在此基础上,测定抗氧化剂对羟基自由基(·OH)的清除率.结果表明:该体系反应灵敏、稳定性高,可作为抗氧化剂的筛选方法之一.关键词:Fenton反应;羟基自由基;分光光度法;水杨酸中图分类号:Q503文献标识码:A计,恒温水浴锅等.0引言本实验所用材料为:银耳多糖(本实验室自行提研究表明,自由基是引起人类衰老和许多疾病的重取),所用试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水.要因素,例如癌症、多发性硬化症、帕金森疾病、免疫系1.2溶液的配制[1]统疾病等.羟基自由基(·OH)是人体内最主要的自FeSO4溶
3、液(1.8mmol/mL):称取FeSO4晶体由基,其消除率是反映药物抗氧作用的重要指标.由于0.2736g,用水定容于100mL容量瓶中,使用时稀释-4羟基自由基(·OH)的反应活性大、寿命短(小于109倍.s)、存在浓度低,因此在有关羟基自由基(·OH)的研究H2O2(0.3%):取30%的过氧化氢溶液1.00[1,2]中,其分析测试方法就显得特别重要.mL,用水定容于100mL容量瓶中.目前,检测羟基自由基(·OH)的方法主要有,电子水杨酸-乙醇(1.8mmol/mL):称取水杨酸固体自旋共振法(ESR)、化学发光法、高效液相色谱法0.2486g,用无水乙醇定容于100mL容量瓶
4、中,使用[3-7](HPLC)等,这些方法多数为间接测定方法,且仪器时稀释9倍.特殊,试剂昂贵,使其应用受到一定的限制.在几种常水杨酸-水溶液(1.8mmol/mL):称取水杨酸固用的羟基自由基(·OH)检测方法中,分光光度法较高体0.2486g,用水定容于100mL容量瓶中,使用时稀效液相色谱法和电子自旋共振法简便、直接,且由于其释9倍.所需设备简单,可供一般实验室检测使用,而被广泛采水杨酸-乙醇-水:水杨酸-乙醇与水的比例用.为1∶3.本实验采用可见分光光度法,以水杨酸作为Fen21.3羟基自由基(·OH)的测定ton试剂反应产生的羟基自由基(·OH)的捕捉剂,使向试管中加入110
5、0mL蒸馏水,FeSO4溶液2.00FeSO4、H2O2、水杨酸-乙醇成为一个反应体系,考查mL,水杨酸-乙醇1.50mL,最后加H2O2(0.03%)水杨酸捕获羟基自由基(·OH)的影响因素,并将确定0.10mL启动反应,振荡混合,在波长510nm处测定的Fenton的反应体系用于抗氧化剂的筛选.其吸光度值.1.4自由基清除剂清除羟基自由基(·OH)作用1材料与方法向试管中加入一系列不同浓度多糖溶液1.001.1材料与仪器mL,FeSO4溶液2.00mL,水杨酸-乙醇1.50mL,最本实验所用仪器包括:紫外可见扫描分光光度后加H2O2(0.03%)0.10mL启动反应,振荡混合,水收
6、稿日期:2009-05-12.基金项目:四川省中医药管理局科技专项基金资助项目(2008-01).作者简介:颜军(1971—),男,高级实验师,从事生物活性成分的提取及检测研究1·92·成都大学学报(自然科学版)第28卷浴37℃,保温30min,在波长510nm下测量各自的吸光度值.自由基清除率计算公式为:D=[(A0-AS)/A0]×100%式中,A0为空白管的吸光度,AS为加入自由基清除剂后的吸光度2结果与讨论2.1吸收光谱图3FeSO4溶液用量对体系吸光度的影响分别测定水杨酸-水溶液、水杨酸-乙醇-水吸光度变化不大甚至开始降低.故本实验所采用的溶液、水杨酸-乙醇溶液在波长200～
7、700nm范围内FeSO4溶液用量确定为2.00mL.的吸收光谱(见图1).测量结果表明水杨酸在上述32.3水杨酸-乙醇用量的影响种溶液中的特征吸收没有发生变化.测定如1.3所述根据2.2实验的结果,确定FeSO4溶液用量为2反应体系的吸收光谱(见图2),发现此反应体系在mL,改变水杨酸-乙醇的体积,其他反应条件不变,490～550nm波长处有吸收.这说明水杨酸作为捕捉考查水杨酸-乙醇的用量对体系吸光度的影响,结剂可成功捕捉Fenton试剂产生
