人类基因组的物理图谱与大规模DNA测序 Physical Mappin.pdf

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1、遗传HEREDITAS(Beijing)20(6):41一471998-W蕊巨人类基因组的物理图谱与大规模DNA测序于军（中国科学院遗传研究所人类基因组中心。北京100101)PhysicalMappingandLakge-scaleSequencingoftheHumanGenomeYUJun(HumanGenomeCenter,InstituteofGenetics,ChineseAcadmySciences,Beijing100101)1历史的回顾物理图谱的制作是与分子克隆技术分不开的。限制性内切酶的发

2、现，导致了第一个物理图谱的完成(SV40;Danna与Nathans,1971)。新克隆技术，尤其是YAC(YeastArtificialChromosome）和BAC(BacterialArtificialChromosome)的发明，使物理图谱的制作向前大大地迈进了一步。它们的克隆片段长度使STS(SequenceTaggedSite;Olson等，1989）成为有力的物理图谱路标，而保证7图谓的联贯性。大肠杆菌、酵母和C.elegans等物理图谱的完成则标志着制作技术的成熟，有了精确的物理图谱，测序就变

3、得常规化了。第一个生命基因组（(PhiX174))顶序的测定是1977年在英国的Sanger试验室完成的，而Sanger的酶法测序以其速度与准确性很快取代了Maxam和Gilbert的化学法。大规模测序的开始是以荧光自动分析仪的发明开始的(Hunkapiller等，1991)。它不仅效率高而且测序的质量也比手工操作高得多。由于DNA多聚酶的不断修饰和荧光底物的不断更新，在很长的一段时间里，荧光测序法会保持主导地位。毛细管电泳也有可能在不久的将来取代现在的平板电泳。现在的难点之一，是由于受到毛细管的空间和电泳介

4、质的限制使读序的长度不够，一般停留在300by到450by左右，而平板电泳则高达600by到900bp左右。除了基本技术和仪器外，测序的策略也很重要。散弹测序法（ShotgunSequencing）是策略的代表作之一。它主要依赖于计算机技术将单一读序自动组装起来，而减少人工操作。人类基因组物理图谱的初期完成主要有两个标志：全基因组和各染色体物理图谱。全基因组物理图谱是由法国DanielCohen领导的CEPH(Centred'EtudeduPolymorphismeHumain）和美国EricLander领导

5、的Whitehead基因组中心分别完成的。由于他们制作物理图谱是为遗传图谱打基础，分辨率较低，仅在0.5到1Mb左右。单个染色体物理图谱的分辨率则高得多，一般要求在lOOKb左右．完成最早的单个染色体是Y和21号。质量最高的数X和7号染色体．分辨率其实有两个重要的参数二有顺序路标（(OrderedMarkers)的平均距离和总路标的平均距离。比如，美国NIH的EricGreen小组制作的7号染色体物理图谱中，STS间的平均距离是79Kb．但是这些路标只有百分之九一是有明确顺序的，所以其真正分辨率只有平均88K

6、b(Bouffard等，1997)。再如，EricLande：领导的MIT小组（Hudson等，1995)的图谱只有170Kb的分辨率，而有顺序路标的平均距离则只有1MboDNA大规模顺序测定是在低精度遗传图谱与物理图谱宣告完成后，酵母和C.elegans测序工作显示不容质疑的成功希望时开始的（Olson,1995)。英国Sanger中心的JohnSulston和美国圣路易斯华盛顿大学的RobertWaterston是这个领域的先驱。不容忽略的是这些物理图谱的关键作用，它们为测序提供了基本原料。没有这样的基本

7、原料，测序的速度就会受到限制。42遗传HEREDITAS(Beijing)199820卷2制作物理图谱的基本要素与原理2.1物理图谱制作的基本要素2.1.1路标（Landmark)路标是用来标位的工具。对于物理图谱来讲有STS(Olson等，1989）和限制性内切酶位点。对于遗传图谱来讲有RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism),microsatellites，和SNP(SingleNucleotidePolymorphisms).2.1.2单位（Unit)单位的

8、概念比较复杂一些，限制性内切酶的酶切片段是限制性内切酶物理图谱的基本单位，STS则由它相对整个基因组的专一性而自成单位。基因组的每一个碱基是物理图谱的终极单位。2.1.3顺序（Order)由于物理图谱与遗传图谱都是一维空间的，顺序的测定就成了制作图谱的终极目的。顺序是路标间的相对位置。这个相对位置具有绝对的专一性。2.1.4可复制的DNA片段（ClonableFragments）目前，可复制的的DN