DNA测序与基因芯片

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1、DNA测序与基因芯片一、背景介绍20世纪70年代，弗雷德·桑格尔（FrederickSanger）发明基因测序技术，并因此获得诺贝尔奖。1990年10月，在全球范围内引起巨大反响的“人类基因组计划”（Humangenomeproject,HGP）正式启动，至2003年，中、美、日、德、法、英等6国科学家联合宣布人类基因组序列图绘制成功，历时13年，耗资额近30亿美元。基因组计划是人类为了探索自身奥秘所迈出的重要一步，是继曼哈顿计划和阿波罗登月计划之后，人类科学史上的又一伟大工程。就像了解人类身体构造对于目前医学发展的贡献，对人类基因组的

2、了解对医学和其他健康科学提供必不可少的支持，可以达到从根本上认识生命的起源、种间、个体间的差异的原因，疾病产生的机制，以及长寿、衰老等困扰着人类的最基本的生命现象。此后，基因测序技术突飞猛进，测序时间明显缩短，且成本也有大幅下降。但是，随着越来越多的基因组序列得以测定，基因序列数据也正以前所未有的速度迅速增长。建立一种方法去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能，就大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要，而基因芯片的出现为解决此类问题提供了光辉的前景。基因测序和基因芯片是两种重要的基因组学研究方法，是解开包括癌症在内的

3、很多疾病与基因之间紧密联系必不可少的工具，在生命科学研究领域有着极其广泛的应用前景二、主要技术路线1.基因测序测序技术最早可以追溯到20世纪50年代，早在1954年就已经出现了关于早期测序技术的报导，即Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列。直至1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。此后三十几年的发展中陆续产生了第二代测序技术，这些技术都采用了合成测序法，只是在DNA阵列的排布、DNA簇扩增，以及基于酶的测序生化反应方面存在差异。最近，Hel

4、icos公司的单分子测序技术和OxfordNanopareTechnologies公司正在研究的纳米孔单分子测序技术被认为是第三代测序技术。测序技术正向着高通量、低成本、长读取长度的方向发展。8（1）第一代测序技术Sanger测序法，又称末端终止法测序技术，其基本原理是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个独立的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP），并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，

5、使延长的寡聚核苷酸选择性的在四种脱氧核苷酸三磷酸（G、A、T或C）处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几至几千碱基的链终止物。它们有共同的起点，但是终止在不同的核苷酸上，因此长度各有不同，通过凝胶电泳将这些DNA片段进行分离，同时借助自显影、非同位素标记或其它方法等进行检测。Sanger测序法经历了从最初的手工测序到半自动化、全自动化的发展。目前，最先进的一代测序设备是AppliedBiosystem3730XL测序仪。它采用毛细管电泳代替平板电泳分离技术，可以提供高

6、质量、高通量的片段读取和序列分析，应用灵活而广泛，同时可分析96或384个样品，不间断24小时运行，自动灌胶、上样、电泳分离、检测及数据分析。如今，测定每千个碱基序列的成本是0.5美元，每天的数据通量可以达到600000个碱基，原始数据的准确率可以高达99.999%。然而，由于其对电泳分离技术的依赖，第一代测序技术在速度和成本方面都已达到了极限，使其很难有进一步提升分析速度和提高并行化程度的空间，并且很难通过微型化降低测序成本。因此，需要开发全新的技术来突破这些局限。尽管如此，第一代测序技术不会很快消失，它将于新的若干测序平台并存。其久

7、经考验的方法可靠、准确，且已形成规模化，特别是在PCR产物测序、质粒和细菌人工染色体的末端测序、以及STR基因分型方面，将继续发挥重要作用。（2）第二代测序技术第二代测序技术作为对传统测序一次革命性的改变，是最近几年建立的高通量技术，其特点是一次测序反应可以产生千万到亿万条序列，而测序的成本大大降低，因此又称下一次测序技术（NextGenerationSequence，NGS）。所有下一代测序平台的核心思想都是边合成边测序（SequencingbySynthesis），即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA序列。目前为止，3种广泛使用

8、的商业化平台技术是Roche公司的454FLX技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。它们基本都是在20世纪90年代末被发明和开发出来，在2005年前后商业化，通过几年的发