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1、DNA测序技术的发展2012112339一、DNA序列测定的意义二、测序技术的建立三、DNA测序技术的发展四、DNA测序技术的展望五、DNA测序技术的应用DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求对DNA一级结构的详细了解。一、DNA序列测定的意义人类基因组计划（HumanGenomeProject－HGP）于1990年正式启动，其主要目标有：识别人类DNA中所有基因（超过10万个）；测定组成人类DNA的30亿碱基对的
2、序列；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。已于2003年完成。人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的科学工程，它奠定了21世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。造福人类的HGP1949年,FrederickSanger开发了测定胰岛素两条肽链氨基末端序列的技术,1953年测定了胰岛素的氨基酸序列。1950年，Edman提出了蛋白质的N端测序技术,后来在此基础上发展出了蛋白质自动测序技术。1965年，Sanger等发明了RNA的小片段序列测定法,并完成了大肠杆菌5Sr
3、RNA的120个核苷酸的测定。同一时期,Holley完成了酵母丙氨酸转运tRNA的序列测定。蛋白质和RNA的测序技术二、测序技术的建立1975年，Sanger和Coulson发明了“加减法”测定DNA序列。1977年，Sanger在引入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)后,形成了双脱氧链终止法,使得DNA序列测定的效率和准确性大大提高。1977年，Maxam和Gilbert报道了化学降解法测定DNA的序列。DNA测序技术的建立DNA序列测定技术出现后,迅速超越了蛋白质和RNA测序技术,成为现代分子生物学中最重要的技术。三、DNA测序技术的发展第一代DNA测序技术第二代DNA测序技
4、术第三代DNA测序技术1、第一代DNA测序技术第一代DNA测序技术：传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们的基础上发展来的各种DNA测序技术。第一代DNA测序技术包括：化学降解法、双脱氧链终止法、荧光自动测序技术和杂交测序技术。1.1化学降解法基本原理:利用特异的选择性试剂，专一性的随机断裂DNA成不同长短的片段。根据试剂的选择性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳上的区带位置，判断DNA片段末端核苷酸的种类，从而测出DNA的序列。将双链DNA样品变为单链↓每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带↓分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群
5、体↓电泳,读取DNA的核苷酸顺序技术路线碱基特异修饰方法GPh8.0,用硫酸二甲酯对N7进行甲基化,使C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去C1.5mol/LNaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶Maxam-Gilbert法所用的化学技术化学降解法刚问世时，准确性较好，也容易为普通研究人员所掌握，因此用得较多。而且化学降解较之链终止法具有一个明显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成产生的拷贝，排除了合成时造成的错误。但化学降解法操作
6、过程较麻烦，且用到放射性物质，逐渐被简便快速的Sanger法所代替。1.2双脱氧链终止法又称为Sanger法。该法的原理是：利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleosidetriphosphate，ddNTP）作为链延伸终止剂。在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列。POH
7、dNTPddNTPPOHOHPPPPOH双脱氧链末端终止法测序原理示意图Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。1.3荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了DNA测序的速度和准确性。目前，应用最广泛的应用生物系统公司(appliedbiosystems，ABI)3730系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的DNA测序仪。如ABI3730XL测序
