dna测序技术及其应用.

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1、DNA测序技术的发展与应用指导老师：张椿雨小组成员：胡娜娜，武巧，姚淼，贾明明引言第三代测序技术测序技术的应用与展望第一代测序技术第二代测序技术1引言DNA序列测定的意义DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求对DNA一级结构的详细了解。造福人类的HGP人类基因组计划（HumanGenomeProject－HGP）于1990年正式启动，其主要目标有：识别人类DNA中所有基因

2、（超过10万个）；测定组成人类DNA的30亿碱基对的序列；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。已于2003年完成。人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的科学工程，它奠定了21世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。DNA测序技术的历史与发展测序技术最早可以追溯到20世纪50年代。早在1945年就已经出现了关于早期测序技术的报导，即Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列。1977年Sanger等发明的双脱氧核

3、苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。此后在三十几年的发展中陆续产生了第二代测序技术，包括Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。DNA测序技术的历史与发展最近，Helicos公司的单分子测序技术、PacificBiosciences公司的单分子实时(SingleMoleculeRealTime,SMRT)测序技术和OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的纳米孔单分子测序技术被认为是第三代测序技术。测序技术正在向

4、着高通量、低成本、长读取长度的方向发展。2.第一代测序技术化学降解法基本原理：利用特异的选择性试剂，专一性的随机断裂DNA成不同长短的片段。根据试剂的选择性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳上的区带位置，判断DNA片段末端核苷酸的种类，从而测出DNA的序列。技术路线将双链DNA样品变为单链↓每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带↓分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体↓电泳,读取DNA的核苷酸顺序化学降解法刚问世时，准确性较好，也容易为普通研究人员所掌握，因此用得较多。而且化学降解较之链终止

5、法具有一个明显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成产生的拷贝，排除了合成时造成的错误。但化学降解法操作过程较麻烦，且用到放射性物质，逐渐被简便快速的Sanger法所代替。双脱氧链终止法又称为Sanger法。原理：利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链延伸终止剂。在测序引物引导下，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，合成链序列，由此推知待测模板链的序列。双脱氧链末端终止法测序原理示意图

6、POHdNTPddNTPPOHOHPPPPOHSanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了DNA测序的速度和准确性。目前，应用最广泛的应用生物系统公司(appliedbiosystems，ABI)3730系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的DNA测序仪。3730全自动测序仪杂交测序技术该方法不同于化学降解法和Sanger法，是利用DNA杂

7、交原理，将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上，把待测的DNA样品片段变性后与其杂交，根据杂交情况排列出样品的序列信息。杂交测序检测速度快，采用标准化的高密度寡核苷酸芯片能够大幅度降低检测的成本，具有部分第二代测序技术的特点。但该方法误差较大，且不能重复测定。通过几十年的逐步改进,第1代测序仪的读长可以超过1000bp,原始数据的准确率可以高达99.999%,测定每千碱基序列的成本是0.5美元,每天的数据通量可以达到600000碱基。第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用,如人类基因组计划(humangenomep

8、roject,HGP)主要基于第一代DNA测序技术。目前基于荧光标记和Sanger的双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。2.第二代测序技术尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作