《CR与DNA测序》PPT课件

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1、知识体系PCR技术简史原理反应体系技术特点结果检测测序技术原理衍生技术AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的复制叉子代DNA参与DNA复制的物质底物(substrate):dNTP——加入聚合酶(polymerase):DNA聚合酶——分离模板

2、(template):DNA母链——提取引物(primer):——人工合成其他的酶和蛋白质因子——Mg2+,PCR仪PartI聚合酶链反应（Polymerasechainreaction,PCR）一、PCR技术简史PCR的实现1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件：摸板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合适的缓冲体系，以及DNA变性、复性及延伸的温度与时间。第一

3、节常规PCR技术提高效率的思路双链单链循环DNA聚合酶仪器改进高温低温PCR的改进与完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都需要重新添加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。这种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致聚合酶钝化，每

4、加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等从一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的

5、60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别，将此酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。二、PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本

6、反应步骤构成：1、基本原理②退火（annealing）（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，将温度降至引物的Tm值左右或以下（55℃左右），引物与模板DNA单链的互补序列配对结合，形成杂交链。①变性（denature）：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。③延伸(extension)：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制

7、原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。以上三步为一个循环，约需2～4分钟，每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，大约2～3小时后，新生DNA片段理论上可达到2n-1个分子拷贝。PCR反应的基本原理示意图3’TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG........…GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT5’5’ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA3’变性（950C，30s）3’TAT

8、TCGGGCTTTCCAAGCAACTAG..........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT5’5’ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC........…CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA3’退火（450C～550C，30s～1min）5’ataagcccgaaaggt3’3’aacggctaggcattt5’TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCT