dna测序仪—医学讲解课件

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1、第十四章全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪元素周期表的发现奠定了二十世纪物理、化学研究和发展的基础元素周期表“基因组序列图”将奠定二十一世纪生命科学研究和生物产业发展的基础！“基因组”----生命科学的“元素周期表”人体解剖图奠定了现代医学发展的基础生命的奥秘蕴藏于“四字天书”之中…GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCATCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCTCCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTC

2、ATCTCGCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT…了解生命现象、解释疾病的发生、诊断和治疗疾病，是生命科学的核心内容之一核酸和蛋白质是控制生命过程的两种重要大分子，其结构或功能异常是导致遗传性疾病或遗传相关性疾病的主要因素或相关因素，是生命科学研究的主要对象核酸分子携带生命活动的全套信息，其基本结构―核苷酸的线性排列构成它的一级结构蛋白质的一级结构是指构成蛋白质的基本单位－氨基酸的排列顺序，研究蛋白质的一级结构是了解蛋白质功能的基础第一节全自动DNA测序仪DNA测序核苷酸序列早

3、期：小片段重叠法通过测定RNA序列来推测DNA序列缺点：既费时又不准确20世纪80年代以后：DNA自动测序仪Sanger双脱氧链末端终止法Maxam-Gilber化学降解法优点：操作简单、安全、快速、准确Sanger双脱氧链末端终止法Maxam-Gilber化学降解法都是根据在某一固定的点开始核苷酸链的延伸，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷酸链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片段的分离和检测，从而获得DNA序列双脱氧链末端终止法更简便和更适合于光学自动探测，故在全自动DNA测序仪中应用

4、广泛原理一个末端标记的DNA片段在4组互相独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异的针对某一种或某一类碱基。因此生成4种放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。Maxam-Gilber化学降解法基本步骤第一步，对特定碱基（或特定类型的碱基）进行化学修饰；第二步，修饰碱基从糖环上脱落，修饰碱基5和3的磷酸二酯

5、键断裂；第三步，比较G、A+G、C+T、C以及A>C各个泳道，可从测序凝胶的放射自显影片上读取DNA序列。特点重现性好，所用试剂简单，易于掌握；所测长度比Sanger法短一些，对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果较好；序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所生成的拷贝；可对合成的寡核苷酸进行测序，用以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA的二级结构及蛋白质-DNA相互作用。无需延伸反应及克隆更适于含有稀有碱基或GC含量高及短链寡核苷酸的测序，可双向标记并测序。比较繁琐费时，过长

6、序列有困难。121314（一）双脱氧链末端终止法测序原理利用DNA的体外合成过程－－聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）DNA聚合酶的催化以目的DNA为模板按照碱基互补配对原则在引物的引导下单核苷酸聚合形成新DNA链普通的PCR反应体系中，加入的核苷酸单体为4种2’-脱氧核苷三磷酸（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）dNTP结构示意图测序反应体系中，加入的核苷酸单体为2’,3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）ddNTP结构示意图PCR（聚合酶链式反应）原理反应所需物质：DNA模板、引物

7、、DNA聚合酶、dNTP、缓冲液每个循环包括：变性（90℃）、退火（54℃）、延伸（72℃）与dNTP相比，ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少一个羟基，反应过程中虽然可以在DNA聚合酶作用下，通过其磷酸基团与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖-OH发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中，但它们本身没有-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此终止。据此原理分别设计四个反应体系，每一反应体系中存在相同的DNA模板、引物、四种dNTP和一种ddNTP(如ddATP)，则新合成的DNA链在可能掺入正常

8、dNTP的位置都有可能掺入ddNTP而导致新合成链在不同的位置终止。由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。ATemplatePrimerdNTPsPolymeraseTerminatorGCT双脱氧链末端终止法测序反应原理（1）TCGACGTCG