《DNA测序技术》PPT课件(I)

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1、从国际谈发展DNA测序技术第一代：双脱氧末端终止法化学降解法第二代：DNA序列分析的自动化第三代：新一代DNA测序技术第一代70年代末，Sanger发明双脱氧核苷酸末端终止法，到现在仍为绝大多数实验室常用的DNA序列分析方法。同期，WalterGilbert发明化学降解法。双脱氧末端终止法原理2’端羟基被氢原子取代形成dNTP3’端羟基再次被氢原子取代形成ddNTP无论体内还是体外条件下的DNA合成反应，DNA聚合酶都是以单链DNA为模板，根据碱基互补配对原则，将适当的dNTP底物连接到事先已经与DNA单链模板结合的寡核苷酸引物的3’羟基末端，形成3’,5’-磷酸二酯键，同

2、时脱去一个焦磷酸（PPi）分子；而新连接到引物上的dNTP底物又提供一个新的3’羟基末端，与下一个dNTP底物连接，以形成下一个3’,5’-磷酸二酯键，以此类推，从而使引物延伸下去最终合成一条与单链模板互补的完整新链化学降解法单侧末端标记的DNA片段在5组相互独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类被修饰碱基，因此形成5组带有放射性标记的长短不一的DNA混合物。它们的长度取决于该组反应所针对的碱基在原有DNA片段的位置。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分别分离这5组DNA混合物，再通过放射自显影来检测末端标记DNA链的电泳区带位置。第二代双脱氧末端终止

3、法操作简便、结果清晰可靠，一次能确定300-500个核苷酸序列，已成为最常用的DNA测序方法。在第二代DNA序列分析的自动化中仍沿用该原理。化学降解法操作繁杂，所用的化学试剂多为有毒物质，且无法进行自动化分析，故在DNA序列分析中很少人用。第二代80年代中期，出现自动测序仪（应用双脱氧终止法原理）、荧光代替同位素，计算机图象识别90年代中期，测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳DNA序列分析的自动化原理利用双脱氧末端终止法的原理，用四种不同的荧光化合物分别标记4种反应产物，把4种反应物混合在一起进行电泳，从而大大提高点用分析的效率，实现了DNA测序的高度自动化。A

4、BI型全自动DNA测序仪：其特点采用专利的4种荧光染料分别标记终止物ddNTP或引物，经Sanger测序反应后，反应产物3’端（标记终止物法）或5’端（标记引物法）带有不同的荧光标记》一个样品的4个测序反应产物可在同一泳道内电泳，从而降低测序泳道间迁移率差异对精确性的影响。通过电泳将各个荧光标记片段分开，同时激光检测器同步扫描，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像。电脑可在电泳过程中对仪器运行情况进行同步检测。结果能以电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种方式输出。ALF全自动激光荧光DNA测序系统:该系统采用非放射性

5、的单一——Cy5荧光素标记测序引物。沿用双脱氧链终止法进行反应，分别生成4组终止于不同种类碱基、带有Cy5荧光素标记的DNA片段。A、G、C和T四组反应物在变形凝胶上电泳，每个泳道都有一个有激光枪和探测器组成的检测装置，当Cy5荧光素标记的DNA条带迁移至探测区并遇上激光时，荧光标记被激活并释放出光信号，光信号有探测器接收，最后电脑将收集到的信号进行处理。在第二代测序技术中最新型自动测序仪为大规模毛细管DNA分析系统，采用涂层毛细管，使信噪比更高，有效提高分辨率，工作效率极大提高，在人类基因组测序和基因结构研究中发挥了十分重要的作用。新一代DNA测序技术＊2005年：焦磷酸

6、测序法（美国RocheAppliedScience）＊2007年：新一代高通量基因测序分析系统——SOLiD（美国应用生物系统公司）＊最新成果：Illumina测序仪在单分子簇的边合成测序技术的基础上，采用了可逆终止化学反应。（美国Illumina公司和英国SolexaTechnoiocy）焦磷酸测序法新一代高通量基因测序分析系统：SOLiD在进行测序反应时应用连接法和双碱基编码原理，他对每个碱基判读2次、用连接酶代替了传统的聚合酶、测序过程中更换引物。Illumina测序仪：其在单分子簇的边合成边测序的基础上采用了可逆终止化学反应。Solexa技术保证了每次延伸反应时4种

7、dNTP的浓度均匀，有效地避免了掺入错误。新一代测序技术主要基于循环芯片测序法。它的Helicos单分子测序技术、SMRT技术和纳米孔单分子测序技术正向着更高通量、更低成本、更长读取的方向发展。其出现弥补了传统测序方法的缺陷，借助区数据产出通量高、测序成本低的显著优势，新一代测序技术为解决基因分子生物学问题开辟了新途径从国内谈近况临床基因测序的发展2014年2月，国家食品药品监督管理总局（下称食药总局）、国家卫生和计划生育委员会（下称卫计委）一纸叫停了临床基因测序，原因是相关产品和技术并没有通过审批便在市场上流通开