《物理图谱与测序》PPT课件

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1、第三章DNA物理图谱的构建及序列测定物理图谱（physicalmap）物理图/限制性图谱（restrictionmap）是各种限制性内切酶切点在某一DNA分子或DNA片段上的排列，由于各酶切点之间的距离是以碱基对（kbp→mbp）表示的，所以可计算出二切点间的绝对距离，因此限制图也称物理图。物理图谱的构建是基因组研究的重要组成部分。质粒pBR322的限制图一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）细菌核酸内切酶识别、剪切特殊双链DNA序列用途：DNA物理图谱构建、DNA序列分析、基因分离

2、、基因定位、DNA重组1.细菌的修饰作用和限制性核酸内切酶的发现20世纪50年代，Luria&Human、Bertani&Weigle：噬菌体→细菌菌株1，正常生长。→细菌菌株2，生长受到强烈抑制；少数存活，再次感染菌株2，正常生长——受到宿主的特意修饰。机制？《老虎机与破碎的试管》LuriaE.coli菌株λ噬菌体感染率KBCE.coliK110-410-4E.coliB10-4110-4E.coliC11111寄主控制的专一性（hostcontrolledspecificity）几乎所有研究噬菌体的科学家

3、都将之视为一种有趣但似乎没有什么意义的现象而忽略了。1962，Arber（瑞士）：宿主的修饰在噬菌体DNA上进行1965，Arber：宿主所致的限制现象中伴随有噬箘体DNA的大量降解，——宿主对入侵噬菌体的修饰与噬菌体DNA降解密切相关；预言细菌中存在位点特异性限制酶；修饰是宿主甲基化酶作用结果：建立细菌限制-修饰（R-M）系统概念如何分离酶？Arber假说细菌中存在具有相同位点特异性的2种酶：限制性内切核酸酶；甲基化酶——细菌利用限制酶特异性识别、降解噬菌体DNA；细菌自身DNA分子通过甲基化修饰酶进行甲基化修饰

4、保护，阻止限制酶的作用。细菌的限制-修饰系统是抵御外来侵袭的一种重要措施1978年诺贝尔生理学或医学奖限制性核酸内切酶的发现1968年，Linn&Arber于大肠杆菌B中发现第一种限制性内切核酸酶（I型：识别特异剪切随机）。1968年，Meselson&Yuan从大肠杆菌K中获得高纯度限制性内切核酸酶（I型）。识别DNA序列上特定的位点，但其切断DNA分子时，却具有很大的随机性；兼具修饰功能，活性依赖一种小分子——S-腺苷甲硫氨酸Meselson错失诺贝尔奖1970年，研究有关流感嗜血杆菌的遗传重组问题，噬菌体P2

5、2的DNA加入到嗜血杆菌的提取液中，DNA消失了——Smith从流感嗜血杆菌Rd中分离出第一种II型限制性内切核酸酶——HindII。与Arber共享1978年诺贝尔生理学或医学流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA，其细胞提取液可降解E.coliDNA，但不能降解自身DNA，→HindⅡ限制性内切酶。HindⅡ限制性内切酶位点和切割位点如下：5'…GTPy↓PuAC…3'            3'…CAPu↑PyTG…5'上世纪80年代，限制性内切酶开始克隆表达

6、限制-修饰系统Smith等的工作流感嗜血杆菌Rd与其它细菌相似DNA甲基化程度低：m5C，N6-mA；但存在甲基化酶细胞粗提物→磷酸纤维素层析→蛋白；*S-腺苷甲硫氨酸转移甲基→鱼精DNA/T7DNA。——检测出4种腺嘌呤甲基化酶其中一种处理T7DNA→免受HindII裂解；先用HindII处理鱼精DNA→对应甲基化位点破坏。——限制性内切酶-修饰性甲基化酶共识别位点限制性内切酶识别位点处的甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去，阻碍了限制性内切酶的作用。磷酸纤维素层析——阳离子交换层析氨基酸的等点点（isoelectri

7、cpoint，pI）在一定的pH条件下，氨基酸分子中所带的正电荷和负电荷数相等，即净电荷为零，此时溶液的pH称为该氨基酸的等电点(isoelectricpoint,pI)。氨基酸在等电点时溶解度最小。正离子pHpI离子交换层析分离蛋白质甲基转移酶催化甲基化（methylation）甲基供体：S-腺苷甲硫氨酸甲基受体：被修饰碱基（A、C多于G、T）碱基的甲基化修饰不是随机的，而是限于一定的顺序或DNA的某一区域，在甲基化酶的作用下进行，甲基化是可逆的。甲基化的意义：帮助细胞识别和区

8、分自身DNA和外来DNA；调节基因表达；帮助DNA修复等。腺苷转移酶PPi+Pi+甲硫氨酸ATPS-腺苷甲硫氨酸(S-腺苷Met，SAM)S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶RHR—CH3腺苷SAMS—腺苷同型半胱氨酸同型半胱氨酸SAM为体内甲基的直接供体H2O腺苷或胞嘧啶的甲基化是多种细菌的限制修饰系统的一部份真核生物中也存在广泛的DNA甲基化修饰现象哺乳动物DNA