转甲状腺素蛋白基因在酵母中的表达.pdf

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1、!7卷)期生物工程学报O@FB!70@B)!"""年!&月/)’01+12-3.0"%-4!’-,1()0-%-$5WDI@2=?!"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""转甲状腺素蛋白基因在酵母中的表达程颖%!!高卜渝!宋大新%袁汉英!陈永青%李育阳!!（!(复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室%(复旦大学微生物系上海%&&)**）柳湘田培坤顾健人（上海市肿瘤研究所上海%&&&*!）摘要用限制酶!"#+,将含人--.基因的/01片段（约)"*23）

2、从质粒345$--.上切下后并插入到分泌型载体3+,6$4,的!"#+,位点上，经酶切鉴定重组质粒3+,6$4,$--.上的--.基因插入方向正确。将3+,6$4,$--./01用!$%,,酶切后，转入真核表达系统———毕赤氏酵母。得到的转化子经摇瓶发酵，上清液用!784/4$91:;检测，有--.<的表达。经/;1;$4=3>=?@A=CD?EF4$%&&分子筛层析，得到纯化的--.<。体外实验表明--.<对肝癌细胞有抑制作用。关键词转甲状腺素蛋白，分泌型载体，毕赤氏酵母，肝癌细胞分类号GH#"文

3、献标识码1文章编号!&&&$*&’!（!"""）&)$&)%#$**转甲状腺素蛋白（--.，I?CJAI>E?=IKJ）又被称为前白蛋白（91，3?=CF2LMKJ），是一种由肝脏、脉络丛和眼产生的蛋白，它与转运甲状腺素和维生系1代谢有关。其分子量约为［!，%］。每个亚基为一个!%H个CC组成7)N/，由四个相同的亚单位组成耐热耐酸的四聚体的多肽。在一种家族性的遗传病———淀粉样病变中，生殖细胞的--.基因的突变可导致中枢神经和心血管系统产生大范围的淀粉样物质［*，)］。--.主要由肝细胞合成，在肝脏受到损伤的病人的血清中-

4、-.的含量明显降低［7，’］。上海肿瘤研究所首次报道肝癌中--.基因转录受阻，并在基因结构上存在缺陷。而且体外实验表明--.对肿癌细胞的生长有明显的抑制作用，因此--.基因可能是与人肝癌相关的抑癌基因的候选者［H］。由于血浆中提取--.产量低、步骤繁琐，所以我们考虑用基因工程的手段大量生产--.。为摸索条件，我们首先在酵母中进行较为简单的转甲状腺素融合蛋白（--.<）的表达，为今后非融合蛋白的表达打下基础。!材料与方法!"!菌种质粒和细胞株携带人--.基因的质粒345由上海肿瘤研究所保存；分泌型载体3+,6$4,、大肠杆菌：

5、,0O!AQ.!H（?RMS）AL3;))"RI>K$!TE?1?=F1!##&FCDU!$M!7$（FCDUV1$C?T<）Q=@.S

6、为#+/+0’公司产品。所有氨基酸、生物素、甘油、甲醇、山梨醇均为华美生物公司产品。标准低分子量蛋白为丽珠公司产品。!"$培养基!"$"!大肠杆菌培养基：1&培养基：23蛋白胨，23氯化钠，4563酵母提取粉；1&%培养基：1&加244／71氨苄青霉素。!-!"$"#酵母培养基：.89#培养基；23酵母提取粉，23蛋白胨，:3葡萄糖；选择培养基：25;"3.$&（.(<=>$+>*’-(,&<=(），:3葡萄糖，每升培养基中加谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸各647-，生物素45"7-。&?@.培养基：23酵母提取

7、粉，:3蛋白胨、25;"3.$&，每升培养基中含45"7-生物素，2471甘油及2447127’A／1磷酸盐缓冲液。&??.培养基：23酵母提取粉，:3蛋白胨、25;"3.$&，每升培养基中含45"7-生物素，671甲醇及2447127’A／1磷酸盐缓冲液。!"$"$细胞培养基：#?8?培养基：含三抗（244B／71青霉素、2447-／71链霉素、;!-／71两性霉素）及243小牛血清。!"%方法!"%"!有关质粒#$%抽提、酶切、回收、连接和转化等均按参考文献［C］操作。!"%"#大肠杆菌重组质粒DEF1GHFG!!I#$

8、%的酶切鉴定及其对毕赤氏酵母的转化：大肠杆菌的重组质粒DEF1GHFG!!I#$%用!"#IF和$%&F酶切鉴定，然后经’(&FF酶切，分离纯化后用电转化法对毕赤氏酵母进行转化。!"%"$菌体的诱导表达：将筛选得到的毕赤氏酵母转化子分别接种于6471&?@.生长培养基中;4J、振荡过夜至)