水源中肠道病毒及胃肠炎病毒检测方法的研究进展及意义.pdf

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微生物与感染JournalofMicrobesandInfections，June25，2012，7(2)：111—116http：／／jmi．fudan．edu．cn·综述·水源中肠道病毒及胃肠炎病毒检测方法的研究进展及意义匡小舟，滕峥，张曦上海市疾病预防控制中心，上海200336摘要：人肠道病毒及胃肠炎病毒借助水体传播可能引起水源影响区域的疫情暴发。尤其对免疫力发育尚不完全的儿童和免疫缺陷人群，这些病毒感染可能会引起严重的临床症状和并发症。因此，做好水源中肠道病毒及胃肠炎病毒的检测和监测，将对这些病毒所致疾病的防范和控制有重要意义。本文综述了目前国内外针对水体中的病毒浓缩和检测所做的相关研究，包括从水样中浓缩、纯化病毒的不同方法及建立在分子生物学和细胞培养基础上的病原检测方法。这些研究为进一步建立行业标准和实验室检测规范提供了重要的参考和技术依据。关键词：滤膜浓缩法；聚乙二醇沉淀法；蚀斑试验Detectingenterovirusesandgastr0enteritisvirusesinwatersamplesKUANGXiao-Zhou，TENGZheng，ZHANGXiShanghaiMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention，Shanghai200336，ChinaAbstract：Enterovirusesandgastroenteritisvirusesinwatermayleadtodiseaseoutbreaksaroundthecontaminatedarea．Theinfectionscanresultinsevereclinicalsymptomsandcomplicationsinanimmuno-compromisedpopulationaswellasinchildren，whoseimmunityisnotfullydeveloped．Therefore，effectivedetectionandmonitoringofenterovirusesandgastroenteritisvirusesfromwatersourcesiscriticalinthepreventionandcontrolofassociateddiseasescausedbytheirinfection．Thecurrentprogressesonvirusenrichmentmethodsandmolecular-orcell·-basedvirusdetectionmethodsforwatersamplesarereviewedinthispaper．AbetterunderstandingofthesemethodswillhelpUStobuildthestandardsforindustryandlaboratorystandards．Keywords：Membraneadsorption-elutionmethod；Polyethyleneglycolprecig}itationmethod；Plaqueassay肠道病毒和胃肠炎病毒专性寄生于人类胃肠生存，在水中存活时间也可长达数周[2。]。虽然它道，引起宿主细胞感染。其传播主要通过粪．口途们无法在水中直接复制，但一旦被摄人人体内，即使径，感染病毒的患者可在每克粪便中排泄出10。～低剂量也能引起疾病E。因此，这些生存于污染环10u个病毒颗粒l_1]，因此在与排泄物直接接触的原境水中的病毒对人类健康构成潜在威胁。例如，用水中病毒浓度往往较高。肠道病毒与胃肠炎病毒自于农业灌溉与施肥的废水和污水、污泥就是一种病身物理、化学性质稳定，不仅可在人类胃肠道内稳定毒污染农作物的可能来源和途径[5]，世界各地也曾基金项目：上海市卫生局资助项目(研2011．16)通信作者：张曦Correspondingauthor．ZHANGXi，E-mail：xzhang@scdc．sh．ca 微生物与感染JournalofMicrobesandInfections，June25，2012，7()．：鱼多次出现由水源污染引起暴发流行的各种病毒性肠属[1，其亚属包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(A道疾病或腹泻事件J。组、B组)、埃可病毒和一组由血清型号标记的肠道目前的污水处理程序，如活性沉渣处理、氧化病毒(66~71型及新鉴定的73~75、77、78型)。肠塘、活性炭处理、过滤、石灰混凝及加氯，只能消除废道病毒颗粒由小的无包膜二十面体组成，直径只有水中50％～90％的病毒[8]，因此一些病毒仍能在污27~30nm。基因组由单股正链RNA组成，复制发水处理后被排放。大多数国家对废水处理系统性能生在脊椎动物细胞的细胞质内[1_16_。肠道病毒感监测的指标主要依赖于指示性细菌。我国现行的染的特点是高异质性临床表现，同一种病毒可引起《生活饮用水卫生标准》(GB5749．2006)和废水再几种不同的临床疾病，而不同肠道病毒也可引起相利用中的《再生水水质标准》(SL368-2006)中微生同的临床症状_1。脊髓灰质炎病毒通常引起亚临物污染指标一栏也只包括了细菌和寄生虫的i贝0定标床感染或严重感染，如无菌性脑膜炎和脊髓灰质炎准，并没有涵盖对涉水病毒的检测。但细菌与病毒(A,JL麻痹)[1。柯萨奇病毒、埃可病毒及其他型别污染并不一定有关联[9]，细菌指标的使用不足以用肠道病毒根据组别会引起不同的疾病症状，其中包来监测和评价已处理水源的水质。目前病毒检测技括上呼吸道和胃肠道感染、黏膜疹、皮疹、疱疹性咽术灵敏度不高，常规方法如荧光反转录．聚合酶链反峡炎(手足口病)、出血性结膜炎，以及更严重的无菌应(reversetranscriptase-polymerasechainreaction，性脑膜炎、脑炎、麻痹、胰岛素依赖型糖尿病和心脏RT．PCR)只能在样品含高浓度病毒(>2×10疾病[16-18]。copies／m1)的情况下才能将其检出[1。因此，通常引起人病毒性胃肠炎的病原体主要有轮状病情况下，水样在前处理过程中只有通过不同技术手毒、诺如病毒、札幌病毒、肠道腺病毒(血清型为F段有效浓缩，才能检出并证实所含的污染病毒。在亚属的40、41型)和星状病毒等[19,2o]。其中，轮状全球不少因病毒污染水源而造成腹泻暴发的流行病病毒是5岁以下儿童严重腹泻的主要病原体。在发学调查中，实验室也都依赖病毒浓缩的方法，最终成展中国家，每年轮状病毒导致约140万病例，其中约功捕获到致病微生物并还原出原始感染模型。200980万例死亡，占所有腹泻入院患者的25％l_2。轮年6月，意大利南部的加尔达湖大酒店出现腹泻病状病毒为直径约70nm、无包膜的二十面体病毒，属情，当地公共卫生署在之后的4周内上报了几百起呼肠孤病毒科。病毒颗粒由3层蛋白衣壳包裹的病例。实验室除对患者粪便进行检测外，还采集当11段双链RNA组成L2。病毒感染破坏了宿主小地市区的引用水源(即经过理化处理的湖水)，将水肠中上层绒毛上参与绒毛吸收功能的成熟肠上皮细样滤膜浓缩，用一步法RT．PCR进行检测，结果证胞，改变了小肠上皮的功能，助长了分泌型隐窝细胞实诺如病毒与这起水体传播暴发疫情有明显关的增殖，造成吸收不良性腹泻[23,24]。其经典症状是联口。1998年在加勒比岛上的百慕大度假酒店暴2～3d的发热和呕吐，后伴有非出血性腹泻l_2。在发腹泻，影响了包括122名员工在内的至少448人。发达国家和发展中国家儿童中，A群轮状病毒致急美国亚特兰大疾病预防控制中心(Centersfor性胃肠炎最为常见。目前除通过疫苗接种预防外，DiseaseControlandPrevention，CDC)实验室通过还没有特定的治疗方法_2引。诺如病毒则是引起全滤膜浓缩水源和RT．PCR分析，证明疫情与水箱被携带诺如病毒的粪便污染有关_1。同年，通过类似球所有年龄组人急性病毒性胃肠炎的重要病原体[2。诺如病毒和札幌病毒同属杯状病毒科，颗粒对饮用水样本浓缩处理和RT．PCR检测，芬兰也确认了1起发生在黑奈韦西市的腹泻暴发是由于市政为无包膜的二十面体，包含1条约7．7kb的单股正自来水被诺如病毒污染所致。据流行病学调查，这链RNA_2。它引起的暴发呈季节性或散发性特起事件涉及1700~3000例急性胃肠炎病例，再次征，尤其是在半封闭社区，如家庭、学校、养老院、医印证饮用水的氯化处理不足以杀灭水体中的病院、酒店、邮轮等l_2。与其他胃肠炎病毒不同，肠道毒[6]。以上调查研究都指出，如何对水体样本进行腺病毒颗粒虽然也是由无包膜的二十面体衣壳组成高效的病毒浓缩并对目标病原体进行特异性检测是(直径约90rim)，但其基因组为34~48kb的线性确认疫情暴发起因的决定性因素。双链DNA[。。在其纤维和五邻体衣壳蛋白的介导下，腺病毒感染宿主上皮细胞(消化道)，可能造成病1肠道病毒与胃肠炎病毒毒广泛播散，并在儿童和免疫功能低下者中引起死人肠道病毒属小核糖核酸病毒科肠道病毒亡[3。星状病毒是引起婴幼儿急性病毒性肠炎的 匡小舟，等：水源中肠道病毒及胃肠炎病毒检测方法的研究进展及意义最重要病原体之一，直径28~35rim，无包膜，为单的致病病毒是一大挑战。不同国家对如何从水源中股正链RNAE。。星状病毒常与轮状病毒混合感浓缩病毒都做了不少研究[34-37]，美国和欧盟也颁布染。与其他胃肠炎病毒相比，其临床表现较轻，腹泻了一系列指导性的标准和方法，如美国的D5244．持续时间较短[。。92、9510及欧盟的BSEN14486：2005等。归纳起来，这些方法主要基于2种原理(表1)。一种是经2水样浓缩方法离子结合的滤膜过滤浓缩，另一种是聚乙二醇与临床样本中的病毒载量相比，环境中的病毒(polyethyleneglycol，PEG)沉淀。浓度通常较低，因此成功浓缩并检’?贝0到环境样品中表12种从不同水样或模拟水样中浓缩并检测病毒的病毒浓缩法Tab．1Twoconventionalvirusenrichmentmethodsforthedetectionofvariousvirusesfromdifferentwatersamples2．1离子结合滤膜浓缩法pH3．0)洗膜，然后用强碱(如NaOH，pH10．8)洗在离子结合滤膜浓缩病毒的方法中，水中病毒脱病毒[37,38,49]。在多价阳离子存在的条件下，可吸附在负电性滤膜2．2PEG沉淀法上。这种吸附可能不仅是由病毒、滤膜和阳离子三PEG沉淀法在20世纪60～70年代广泛运用者间的静电吸引力引起的，还可能是三者疏水性相于病毒的浓缩和提纯E5o-5z]。PEG是一种无毒、可溶互作用的结果_4。Lukasik等[]在滤膜浓缩水中于水、化学性质为惰性的合成聚合物，可用来沉淀蛋病毒的研究中证实，阳离子的存在促进病毒与滤膜白(也包括由蛋白衣壳包裹的病毒颗粒)。其最主要间的疏水性作用，从而加强病毒吸附。此外，这些带的作用原理由Atha和Ingham提出：PEG就如“惰阳离子的盐类对促进病毒吸附的能力还与其自身的性溶液海绵”，在减少空间结构的基础上将蛋白从溶化合价有关。同样浓度的三价盐(A13)对病毒吸液中排出，从而有效增加蛋白浓度直至超过其饱和附滤膜的促进能力强于二价盐(M)，而同样浓度溶解度，最终蛋白从溶液中析出，出现沉淀[5引。此的二价盐促进吸附的能力又强于单价盐外，还有另一种可能的理论可解释PEG沉淀现象，(Na)_4。传统方法中，吸附在滤膜上的病毒可即蛋白表面电荷对溶解的PEG产生一种不利的热被碱性牛肉浸出液(1％～3％，pH9～11)洗脱。但学效应，导致PEG从“蛋白区域”被排斥出来。因此由于牛肉浸出液中的有机或无机化合物可能会抑制当PEG聚合物以适当的高浓度存在时，蛋白沉淀或cDNA合成和PCR扩增[47,48]，所以另一种洗脱病蛋白结晶就会出现_5。高相对分子质量的PEG浓毒的方法被不少学者采纳，即先用强酸(如H2SO4，缩、纯化病毒的效果比低相对分子质量的PEG更 微生物与感染JournalofMicrobesandInfections，June25，2012，7(2：：鱼有效。传统实验中，肠道病毒根据不同型别，可通过RD、HEP．2、L20B、VERO、HeLa、BGM等易感细3检测方法胞系进行培养ELO,56,57]。当选定的细胞被感染后，3．1分子生物学方法CPE的出现就可作为评估病毒是否具有感染性的自20世纪90年代，分子生物学方法广泛应用指标之一。TCID。终点稀释测试量化了杀死50％于临床和环境研究以检测样本中的肠道病毒。受感染细胞或在50％细胞中出现CPE所需的病毒PCR技术就是基于病毒基因组中肠道病毒属部分数量。值得一提的是，该实验还可用来评估不能形同源性高度保守区域而建立的，比传统借助细胞培成蚀斑的病毒感染性。在细胞培养中，首先将宿主养的检测分析更具优势。研究证明，PCR扩增在诊细胞铺于培养板上，随后将经连续稀释的病毒逐一断肠道病毒感染中快速、特异、敏感L5。通过使用滴加于不同孔板，孵育后对每个病毒稀释度观察并不同的引物，可检测不同组或特定血清型的病记录细胞死亡比例(感染细胞)，通过公式计算获得毒L3。因此，在样本稀少或病毒无法在细胞中诱导TCID50值E引。细胞病变效应(cytopathiceffect，CPE)的条件下，基于蚀斑的检测，就感染剂量而言是判断病毒PCR灵敏度高，是一种可靠的检测手段_5。但传浓度所采用的标准方法，用PFU表示。在实验中，统的PCR对确切估计测试样品中的病毒量还有一将不同稀释度的病毒感染单层宿主细胞，并用半固定局限性，所以一些PCR衍生技术被开发并运用，体培养基覆盖(如琼脂或羧甲基纤维素)以有效防止如套式PCR、多重PCR和实时荧光PCR，进一步提病毒泛滥性蔓延感染。在固定单层细胞内，当病毒高了检测的灵敏度和特异度。感染某个细胞后，该细胞会裂解，病毒空斑就此形套式PCR使用了2对引物，分别是外部引物成E。。。。破胞释放的病毒继而进人相邻细胞，在细胞(目标序列两端的互补物)和内部引物(更接近于中内重复从感染到裂解的周期。被感染的细胞区域会心扩增片段的引物)。第1次扩增反应后，其产物立形成蚀斑(感染区被未感染的细胞包围)，此现象在即作为第2次扩增的模板，因而增强了灵敏度和特指示剂染色后可通过肉眼或光学显微镜观察到。斑异度E38,57]。而多重PCR允许用几对不同引物同时块的形成可能需要3～14d，这取决于不同的病毒。检测不同类型的病毒，但反应产物必须有不同的长斑块数量结合病毒稀释度，可用来计算样本每单位度才能被区分[1。实时定量PCR系统，在荧光探体积的PFu(PFu／m1)。该结果基于每个斑块代表针和与目标序列互补的淬灭基团存在下，可实现同1个感染病毒颗粒的假设，体现了样本内感染颗粒步监测运行时的反应情况。随着测得的PCR产物的数量l_5引。由于检测方法和原理的显著差异，PFU数量增加，荧光信号随之加强，并通过图谱形式呈现与TCID。的检测结果不等价，PFU能更直接估算在计算机上。由于其无法比拟的快速和高特异度，出浓缩后样品中的感染颗粒数量。以及可对目标病毒基因实现半定量测定，不少研究4结语将其用于检测水体中的肠道病毒_3。3．2细胞培养法随着科技发展，越来越多的研究开始运用水体虽然PCR技术在很大程度上提高了水体中肠浓缩、纯化手段，结合分子生物学和细胞培养方法，道病毒的检出率，但其无法对样本中病原体的存活检测环境水体样本中的肠道病毒。这些技术不但实性乃至感染性作出有效评估，此外也无法对不同浓现了传统方法无法完成的检测，填补了传染病实验缩病毒方法就病毒活性影响方面作出比较性判断。室在检测环境标本中的技术空缺，而且为病毒性肠因此，病毒培养和分离作为诊断肠道病毒感染的“金道疾病疫情的流行病学资料提供了实质性证据。但标准”，无论是单独检测还是结合分子生物学方法综是，我国现行的《生活饮用水卫生标准》(GB5749．合判断，都是一道不可缺少的程序E38,58]。有几种较2006)和废水再利用中的《再生水水质标准》(SL常用的、直接基于细胞培养法测得的指标可用于判368．2006)中微生物污染指标一栏只包括细菌和寄断病毒的感染性：一种是病毒在易感细胞中的半数生虫的测定，没有涉及水病毒的检测标准规程。因感染剂量(50％tissuecultureinfectivedose，此，这些国内外的有关研究对我国行业标准制定部TCID。)，另一种则是通过蚀斑试验得到的空斑形门将有所启示，为今后疾病预防和控制单位的实验成单位(plaqueformingunit，PFU)。研究和应用起指导作用。 匡小舟，等：水源中肠道病毒及胃肠炎病毒检测方法的研究进展及意义France_J]．Medicine(Baltimore)，2004，83(4)：245253．参考文献L15JKhetsurianiN，Lamonte-FowlkesA，OberstS，PallanschMA，CentersforDiseaseControlandPrevention．[1]BoschA．Humanentericvirusesinthewaterenvironment：Enterovirussurveillance-UnitedStates，1970．2005[J]．Aminireview[J]．IntMicrobiol，1998，1(3)：191．196．MMWRSurveillSumm，2006，55(8)：1-20．[2]LoS，GilbertJ，HetrickF．Stabilityofhumanenteroviruses[16]RajtarB，MajekM，PolafiskiL，Polz—DacewiczM．inestuarineandmarinewater_J]．ApplEnvironMicrobiol，Enterovirusesinwaterenvironment-apotentialthreatto1976，32(2)：245．249．publichealthl_J]．AnnAgricEnvironMed，2008，15(2)：L3]AbadFx，Pint6R，VillenaC，GajardoR，BoschA．199．203．Astrovirussurvivalindrinkingwater[J]．ApplEnviron[17]FongTT，LippEK．EntericvirusesofhumansandanimalsMicrobiol，1997，63(8)：311g．3122．inaquaticenvironments：healthrisks，detection，and[4]LiWJ，WangXW，，RuiQY，SongN，ZhangFG，OuYc，potentialwaterqualityassessmenttoolsEJ]．MicrobiolMolChaoFH．AnewandsimplemethodforconcentrationofBiOlRev，2005，69(2)：357．371．entericvirusfromwaterEJ]．JViro1Methods，1998，74j18】KmetzschCI，BalkieEM，MonteiroA，CostaEV，dos(1)：99-108．SantosGP，daSilvaEE．Echovirus13asepticmeningitis，L5]MetcalfTG，MelnickJL，EstesMK．EnvironmentalBrazi1_JJ．EmergInfectDis，2006，12(8)：1289—1290．virology：fromdetectionofvirusinsewageandwaterby[19]LoganC，O’LearyJJ，O’SullivanN．Real—timereverseisolationtoidentificationbymolecularbiology-atripoftranscriptionPCRdetectionofnorovirus，sapovirusandover50yearsl_J]．AnnuRevMicrobiol，1995，49：461—487．astrovirusascausativeagentsofacuteviralgastroenteritisI6IKukkulaM，MaunulaL，SilvennoinenE，vonBonsdorfflJ．JVirolMethods，2007，146(1．2)：36．44．CH．Outbreakofviralgastroenteritisduetodrinkingwater[20]LoganC，O’LearyJJ，O’SullivanN．Real-timereversecontaminatedbyNorwalk．1ikeviruses[J]．JInfectDis，transcription．PCRfordetectionofrotavirusandadenovirus1999，180(6)：1771．1776．ascausativeagentsofacuteviralastroenteritisinchildren[7]ChobeLP，ArankalleVA．InvestigationofahepatitisAlJ]．JClinMicrobiol，2006，44(9)：3189—3195．outbreakfromShimlaHimachalPradesh[J]．IndianJMed[21]SteeleAD，PeenzeI，deBeerMC，PagerCT，YeatsJ，Res，2009，130(2)：179．184．PotgieterN，RamsaroopU，PageNA，MitchellJO，Geyer18lCMeReTE，DaSilvaE，Ne1LH．RemovalofwaterborneA，BosP，AlexanderJJ．Anticipatingrotavirusvaccines：humanentericvirusesandcoliphageswithoxidizedcoallJ]．epidemiologyandsurveillanceofrotavirusinSouthAfricaCurrMicrobiol，1998，37(1)：23．27．J1．Vaccine，2003，21(56)：354．360．[9]HeJw，JiangS．Quantificationofenterococciandhuman[22]DennehyPH．Rotavirusvaccines-anupdate[J]．Vaccine，adenovirusesinenvironmentalsamplesbyreal—timePCR2007，25(16)：3137．3141．IJ]．ApplEnvironMicrobiol，2005，71(5)：2250-2255．[23]BurkeB，DesselbergerU．Rotaviruspathogenicity[J]．[1O]KageyamaT，KojimaS，ShinoharaM，UchidaK，FukushiVirology，1996，218(2)：299305．S，HoshinoFB，TakedaN，KatayamaK．Broadlyreactive[24]RamigRF．PathogenesisofintestinalandsystemicrotavirusandhighlysensitiveassayforNorwalk—likevirusesbasedoninfection[J]．JViol，2004，78(19)：10213—10220．real—timequantitativereversetranscription-PCRIJ]．JClinE25]AndersonEJ。webberSG．RotavirusinfectioninadultsMicrobiol，2003，41(4)：1548—1557．_J]．LancetInfectDis，2004，4(2)：91．99．Ln]DiBartoloI，MoniniM，LosioMN，PavoniE，LavazzaA，[26】ParasharUD，GibsonCJ，BreseeJS，GlassRI．RotavirusRuggeriFM．MolecularcharacterizationofNorovirusesandandseverechildhooddiarrheaLJ]．EmergInfectDis，2006，rotavirusesinvolvedinalargeoutbreakofgastroenteritisin12(2)：304．306．NorthernItaly[J]．ApplEnvironMicrobiol，2011，77(15)：L27JHutsonAM，AtmarRL，EstesMK．Norovirusdisease：5545．5548．changingepidemiologyandhostsusceptibilityfactorsEJ]_[12]BrownCM，CannJw，SimonsG，FankhauserRL，ThomasTrendsMicrobiol，2004，12(6)：279．287．W，ParasharUD，Lewis～U．OutbreakofNorwalkvirusin[28]CarterM．Entericallyinfectingviruses．Pathogenicity，aCaribbeanislandresort：applicationofmoleculartransmissionandsignificanceforfoodandwaterbornediagnosticstoascertainthevehicleofinfection[J]．infection_J]．JApplMicrobiol，2005，98(6)：1354-1380．EpidemiolInfect，2001，126(3)：425．432．[29]Maguire，GreenJ，BrownDW，DesselbergerU，Gray[13]CentersforDiseaseControlandPrevention(CDC)．UpdateJJ．Molecularepidemiologyofoutbreaksofgastroenteritisonvaccine-derivedpOliOviruse一w0rldwide，July2009-associatedwithsmallround-structuredvirusesineastAnglia，March2011[JJ．MMwRMorbMortalWklyRep，2011，60UnitedKingdom，duringthe1996-1997season[J]．JClin(25)：846-850．Microbiol，1999，37(1)：81-89．[14]BernitE，deLamballerieX，ZandottiC，BergerP，VeitV，[3O]KajonAE，MoseleyJM，MetzgarD，HuongHs，WadleighSchleinitzN，deMiccoP。Harl6JR，CharrelRN．A，RyanMA，RussellKL．MolecularepidemiologyofProspectiveinvestigationofalargeoutbreakofmeningitisadenovirustype4infectionsinUSmilitaryrecruitsintheduetoechovirus30duringsummer2000inMarseilles，PostvaccinationEra(1997．2003)IJ『．JInfectDis，2007， 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