肠道病毒的pcr检测方法评价与改进

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1、肠道病毒的PCR检测方法评价与改进王芳常州市武进区疾病预防控制中心，江苏常州213164[摘要]目的研究分析PCR检测肠道病毒的方法评价及改进措施。方法择取2013年8月—2014年8月期间在常州第一人民医院接受检测治疗的50例心血管内科急性心肌梗塞患者作为观察组，并抽取同期在该院体检的20例健康者作为对照组。分别采集两组研究对象的血清，均接受PCR方法检测，病毒分离与鉴定，CoxBV中和抗体检测，ELISA检测，并且实施肠道病毒病原与抗体检测，然后对比不同检测方法的结果。结果观察组50例患者中，PCR检测得出EV-

2、RNA阳性者20例，检出率为40%；病毒分离法分离出病毒4株，检出率为8%。通过ELISA检测得出的阳性者12例，阳性率为24%；CoxBV中和抗体检测出阳性为10例，阳性率为20%，二者之间存在显著性差异，P<0.05有统计学意义。结论PCR检测方法具有一定的优越性，其敏感度、特异性更高。.jyqkuliS与HeneryAErlich。PCR技术自产生之后就被广泛地应用于分子克隆、序列分析、传染病及考古研究等很多领域中，所发挥的作用越来越大。正是由于PCR技术的突出作用于贡献，KaryBmuliS在1993年

3、获得了诺贝尔化学奖。医学界也开始渐渐关注并开始广泛使用PCR检测方法，通过引物的设计来完成对大类病毒的综合检测。虽然PCR技术有着独有的特点与优势，但是在对病毒检测的过程中依旧存在着一些不足之处，需要不断改进与优化。近20年来，PCR分子生物领域具有革命性的技术突破，已在生命科学研究领域中得到了广泛应用。该研究对2013年8月—2014年8月在常州第一人民医院接受检测治疗的50例心血管内科急性心肌梗塞患者进行研究介绍肠道病毒的几种检测方法，重点介绍了PCR检测方式的原理、特点，对PCR检测技术应用于肠道病毒的检测进行

4、了评价，通过4种肠道病毒检测方式的对比试验得出了相应的试验结果，证明了之后指出了PCR检测方法的发展，现报道如下。1资料与方法1.1一般资料择取常州第一人民医院接受检测治疗的50例心血管内科急性心肌梗塞患者作为观察组，其中26例男性患者，24例女性患者。年龄范围36~85岁，平均年龄（61.02±6.63）岁。并抽取同期在该院体检的20例健康者作为对照组，其中男性11例，女性9例。年龄范围35~83岁，平均年龄（58.85±7.74）岁。两组研究对象之间的一般资料差异无统计学意义（P>0.05），试验可比性突出

5、。1.2方法1.2.1PCR检测方法检测肠道病毒核糖核酸肠道病毒RNA提取—取血清的样本100μL，在血清中加入GITC变性液220μL，加入氯放与异戍醇的按照49：1进行混合的液体50μL，加入pH值为4.0的NaAc30μL，水饱和酚150μL，将这些液体混合之后进行剧烈的振荡，然后在-20℃的温度直线冷却10min，之后再进行5min（13000r/min）的离心运动，取出其中200μL的液体，在其中加入200μL的异丙醇，之后将新得到的液体在-20℃的环境之下静置1h，再次进行10min（13000r/min

6、）的离心运动，除去上部分的清液，将剩余部分利用乙醇进行洗涤沉淀之后自然挥发或者烘干之后放置备用[2]。PCR方法检测肠道病毒RNA——PCR的成分与比例为双蒸水14.3μL、10XBuffer2μL、10mmolMgCl23μL，15mmoldNTP4μL，引物Q10.5μL，Q20.5μL，Taq酶0.3μL，逆转录酶AMV0.3μL；42℃恒温水浴逆转录30min之后就能够实现RNA的扩增。扩增的程序为95℃变性进行5min，60℃复性30s，70℃延伸90s，实现35个循环之后在进行70℃的延伸5min。将扩增

7、的产物取出5μL之后加入酚蓝显示剂，之后将混合物点样在3%琼脂糖凝胶省，经过30min100V的电泳之后在紫外线之下观测结果[3]。1.2.2病毒分离与鉴定利用常规的病毒分离与鉴定的方法对病人血清中的病毒进行分离，该种方法利用的是Hep-2细胞。当病人的血清出现细胞病变时，利用肠道病毒组合血清与CoxbV单价血清对其进行鉴定。这种病毒分离与鉴定的方法能够对血清与CoxBV1-6型毒株进行诊断。1.2.3CoxBV中和抗体检测分步取患者在入院初与出院前采集的两次血清，通过自身分离病毒或者CoxBV1-6型作为抗原进行检

8、测[4]。血清需要经过1：10稀释，稀释之后的血清要在55℃的环境之下进行30min的灭活，之后经稀释的比例增加到1：320，将再次稀释后的血清与100TCID50病毒进行等量的混合，将混合液置于35℃的环境之下进行1h的结合，之后进行细胞接种，将细胞与病毒进行对照，终点为病毒被完全抑制、细胞病变终止。以阳性为标准进行判定，双份的血清抗体滴度升