实时pcr检测hsv2 dna的方法学评价及应用

《实时pcr检测hsv2 dna的方法学评价及应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、实时PCR检测HSV2DNA的方法学评价及应用【摘要】目的对本室利用TaqManMG技术建立的HSV2实时定量PCR法进行方法学评价及临床应用。方法收集60名近期有流产史妇女的全血及血清标本，分别用FQPCR和ELISA法同时检测，并进行比较；另对FQPCR从重复性、灵敏度、线性范围、特异性几方面进行方法学评价。结果对60份临床标本检测，ELISA法的阳性率为16.7%，FQPCR法的阳性率为31.7%，明显高于前者（P<0.05)。FQPCR法的重复性较好［批内CV(变异系数)值为2.29%，批

2、间CV值为4.76%］、线性范围好(4.75×101～106copies/μl，r=0.998)、灵敏度达到47.5copies/μl、特异性较好（对HSV1、Vero细胞、巨细胞病毒、弓形虫等无特异性扩增）。结论实时PCR测定HSV2方法比传统的ELISA法更快速灵敏，是较有发展前途的新技术。【关键词】实时定量PCR；单纯疱疹病毒2型；生殖器疱疹【Abstract】ObjectiveToevaluateneePCRmethodensfrom60enethods.FQPCRerishigherthanthel

3、atter(P<0.05).Theassayshootherpathogenicmicroorganism)andsensitivityof47.5copies／μ1.ConclusionFQPCRfordetectingHSV2ismoresensitive,fasterthanELISAandisapromisingtechnique.【KeyePCR；HSV2；genitalherpes单纯疱疹病毒2型（herpessimplexvirus,HSV2）是引起生殖器疱疹（genitalherpes

4、,GH）的主要病原体，GH具有长期潜伏性、无法彻底治愈、病情反复发作等特点。孕妇GH还可引起胎儿宫内感染或新生儿感染，导致流产、早产、先天畸形、新生儿死亡或发生严重后遗症［1］。近年来，GH的发病率不断上升，其中部分表现不典型，甚至无症状，而及时准确地对这类感染者诊断并采取相应的防治措施可有效降低感染率［2］。感度不高、耗时较长等缺点。而实时荧光PCR（realtimePCR）是近几年发展较为迅速的新技术，具有高敏感性、高特异性和高精确性等优点。本实验室在前期利用TaqManMGB技术，建立一种检测HSV2的实

5、时定量PCR，现对该方法进行临床应用及方法学评价，结果报告如下。1材料和方法1.1主要仪器及试剂ELISA定量酶标仪Model550BIORAD(美国)；实时定量PCR仪RG3000(澳大利亚)；实时PCR法定量标准品实验室自制；HSV2IgMELISAKIT晶美生物；引物及探针上海基康公司设计并合成；HSV2　SAV株购自中国疾病预防控制中心病毒研究所。1.2标本从2004年1月至2004年6月，以广东省各大医院就诊的近期有流产史60名妇女作为研究对象，收集全血及血清两类标本，并置于-20℃保存备用。1.3

6、方法1.3.1抗HSV2检测对60例受检对象的血清样本作为样本，完全按照试剂盒说明书操作。1.3.2HSV2的FQPCR定量检测分别提取60例受检对象的全血样本DNA，用本实验室建立的实时PCR对HSV2检测。引物及探针根据gG基因片段由上海基康公司设计并合成，分别是：FP:5′CCCCTGTTCTGGTTCCTAACG3′，RP:5′GTGGATGGTGGTGCTGATGATA3′，FAM:5′CCTGCTCTAGATATCCT3′。实时定量PCR反应体系总体积30μl,分别是模板DNA：2.

7、0μl；上游引物(5μm)：3.6μl；下游引物(5μm)：3.6μl；荧光探针(10mm)：0.9ml；dNTPmixture(10mm)：2.4ml；TaqDNA聚合酶：0.2ml；10×PCRBuffer：3.0ml；MgCl2(25mm)：6.0ml；ddH2O：8.3ml。反应条件：95℃5min；94℃15s，60℃60s，30个循环。1.3.3重复性包括批内和批间重复性，批内重复性是一次对HSV2标准毒株重复检测10次，根据测得的Ct值计算标准差(s)和CV值；批间重复性是连续10d对同一样本进行检

8、测，根据测得的Ct值计算s和CV值。1.3.4线性范围将标准品进行系列10倍稀释，得到4.75～4.75×108copies／μl9个浓度。分别以每个浓度的标准品作模板进行荧光定量PCR检测，对所得荧光扩增曲线进行软件处理得到标准曲线。根据r>0.99的原则，判断方法的线性范围。1.3.5灵敏度取已制得的标准品10μl用双蒸水稀释100倍，分别测得其在