肠道病毒柯萨奇b5型巢式rt-pcr检测方法的建立及评价

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterEstablishmentandevaluationofthereversetranscriptionnestedpolymerasechainreactionassayforthedetectionofcoxsackievirusB5ByJingjingDuanSupervisor：Prof．BianliXuEpidemiologyandHealthStatistics一一，CollegeofPublicHealthMay2013原创性声明本

2、人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可

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4、常见的能引起病毒性脑炎的肠道病毒，属于肠道病毒属小核糖核酸病毒，无包膜，单股正链RNA，资料显示其引起的病毒性脑炎在我国广泛存在。病原的分离培养与PCR扩增测序是鉴定CVB5的主要方法和金标准，但由于其缺乏敏感性、检出率低、耗费时间长且费用高，临床上极少采用。。聚合酶链式反应(PCR)做为一种新的分子生物学检测技术，具有操作简单、快速、灵敏度和特异度高、易标准化等特点，已被越来越多地应用到肠道病毒诊断上来。但文献中鲜见检测肠道病毒CVB5的PCR方法，所以本文通过建立一种简单、快速、灵敏、特异的检测CVB5的巢式PCR方法，将其与其它肠道病毒，如Ech06

5、、EV71、CVAl6等进行鉴别，也为以后CVB5感染的流行病学调查和实验室检测提供了一种更为可靠的手段。方法从GenBank下载河南分离株CVB5全基因序列，用DNAStar软件进行同源性比较，在同源性较高的区域选择出引物设计的模板，根据引物设计原则，用PrimerPremier5．0在VPl区设计了三对巢式PCR引物，并用Blast和Oli906．0软件对其进行比对和分析评价。最终将这三对巢式PCR引物合成并进行扩增后，通过凝胶成像方法进行验证确定最终选择的引物。提取病毒标准株RNA并反转录为cDNA，以其为模板通过优化PCR反应条件，并对其灵敏度、特

6、异度和重复性进行评价，最终建立了一种快速、简便、准确的检测肠道病毒CVB5的巢式RT-PCR方法。用建立的巢式RT-PCR方法对新采集的212份病毒性脑炎患者样本进行检测，同时与做为金标准的病毒分离检测方法进行比较评价其应用价值。病原的确定通过将PCR反应产物进行克隆测序后，先用DNAStar摘要软件的SeqMan将测定到的核酸序列进行人工辅助校对，再用NCBI软件进行同源性比较，与GenBank公布的序列进行比对分析，核酸序列比对分析利用DNAStar7．0完成。结果1．以病毒标准株反转录得到的eDNA为模板，最终确定两轮扩增反应总体系均为50山，包括P

7、CR反应液251．tl、eDNA模板1“l、上下游引物各1山、无RNA酶去离子水22pl。在第二轮扩增反应中，取第一轮扩增产物1pl作为模板。反应条件为：94℃3min；94℃，30s，56℃30S，72℃30S，30个循环；72℃10min；4。C，OO。第二轮反应条件除了将第一轮的30个循环改为25个循环外，其他与第一轮相同。2．方法学评价结果：敏感性：将CVB5标准株选用RD细胞进行病毒效价滴定，然后lO倍梯度倍比稀释进行灵敏度实验，成像结果显示第一轮的灵敏度达到10TCID50，第二轮的灵敏度达到104TCID50；特异性：将5株不同的CVB5毒株

8、和Ech025、EV71等4株其他肠道病毒毒株及空白对照进行扩增反