柯萨奇病毒的RT-PCR实验.ppt

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1、柯萨奇病毒的RT-PCR实验室诊断属于小ＲＮＡ病毒科肠道病毒属，最易在灵长类动物细胞中生长。病毒分为Ａ、Ｂ两组。柯萨奇病毒Ａ组有２３个血清型，柯萨奇病毒Ｂ组有６个血清型。柯萨奇病毒单股正链RNA，全长大约7.4Kb，病毒直径为25～30nm，球形，无包膜，病毒衣壳由VP1-VP4等构成，呈20面体立体对称。柯萨奇病毒(Coxsackievirus，CV)的诊断方法：病毒分离、动物接种操作烦琐,成功率低,影响诊断的敏感性；ELISA法检测患者血清中相应的特异性IgM、IgG抗体,但不能获得有关病毒更多的信

2、息；RT-PCR法既可以通过检测病人样本中的病毒RNA来明确诊断,也可以通过进一步的测序来分析病毒流行株特定序列,为基因分型提供依据。两端为保守的非编码区，中间为编码区。5’端共价结合一小分子蛋白质Vpg（约7kDa），与病毒RNA合成和基因组装配有关；3’端带有polyA尾。编码区编码的病毒结构蛋白VP1～VP4，VP1、VP2和VP3均暴露在病毒衣壳的表面，有中和抗原位点；VP4位于衣壳内部，一旦病毒VP1与受体结合后，VP4即被释出，衣壳松动，病毒基因组脱壳穿入。逆转录PCR，或者称反转录PCR(

3、reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。TypesofRT-PCRReactionsStandardRT-PCRusuallywithone-step(recommended)SensitiveandspecificNestedPCRM

4、oresensitivethanstandardContaminationisamajorproblemOnlyforveryexperiencedlabsRealTimeRT-PCRSensitiveandspecificReagentandequipmentcostsareafactorHighthroughputRT-PCR实验程序：标本的采集、标本RNA的提取、引物、RT-PCR反应体系、温度循环参数、琼脂糖电泳、凝胶成像、结果判定及序列测定一步法：反转录PCR在一个管子里完成，得到的全部cDN

5、A产物都一起经PCR扩增，灵敏度更高。两步法：反转录和PCR分开，灵活而且严谨，但灵敏度不如前者高。RNA操作注意事项全程戴手套灭菌、清洁的塑料管或无RNA酶的玻璃制品高压带滤芯枪尖RNA提取试剂要保证无RNA酶所有试剂开盖时要标明日期在RNA提取、RT-PCR和测序过程中使用无RNA酶水操作快捷，提取后的RNA应放在-70度备有冰盒，全程中保持RNA在低温状态下避免反复冻融RNA，防止RNA降解。PCR反应系统的组成：⑴耐热DNA聚合酶（Taq酶）：这是由耐热水生细菌体内提取的一种DNA聚合酶。⑵模板

6、DNA：即待分析的目的DNA，其长度不宜大于10kb。⑶两种引物：为了保证DNA聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补模板DNA链的3`-端。⑷四种脱氧核糖核苷酸：用作底物的dNTPS。⑸缓冲溶液：保证DNA聚合酶催化时所需的适当的溶液pH值PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DN

7、A解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将

8、待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR注意事项PCR关键环节①模板;②引物;③酶dNTP;④循环条件;寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板1、杂质蛋白质；特别是染色体中的组蛋白；2、Taq酶抑制剂；3、在提取制备模板时丢失过多；4、模板核酸变性不彻底；5、模板降解。RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。引物引物质量、浓度