《食品生物技术》.pdf

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1、《食品生物技术》实验指导书北京农学院食品科学系张红星、徐文生编著二00六年九月1实验一质粒DNA的小量制备1．目的学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。2．原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0∼12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经

2、过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。3．器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。4．试剂pET-his质粒载体菌,pMD18-T-NK载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液(溶液II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液III)，RNaseA，95%乙醇，70%乙醇，TEbuffer（pH8.

3、0）。5．实验准备氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20°C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加200mLddwater搅拌完全溶解，用约200μL5NNaOH调pH至7.0，加ddwater至1L，121°C20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTrisHClpH8.0，10mmol/LEDTApH8.0）；溶液II（0.2mol/LNaOH，1%SDS）；溶液III（60mL5mol/LKac，加冰乙酸调pH4.8，补ddw

4、ater至100ml），70%乙醇（-20°C保存），TEbuffer（10mmol/LTrisHClpH8.0，1mmol/LEDTApH8.0）；10mg/mLRNaseA（RNA酶A溶于10mmol/LTrisHClpH7.5，15mmol/LNaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121°C30min）。6．操作步骤+（1）在超净工作台中取5mlLB（Amp），加入灭菌的摇菌管中。（2）从超低温冰箱中取出保存pET-his载体的菌

5、种和pMD-18T-NK的菌种（操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37°C摇床中摇20h。++pET-his菌：接种于5mlLB（Amp）；pMD18-T菌：接种于2mlLB（Amp）（3）取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。pET-his菌：3管（3×1.5ml）；pMD18-T菌：1管（1.5ml）（4）在沉淀

6、中加入100μl溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）（5）加入200μl溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。（6）加入150μl溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。（7）15000rpm离心5min，小心吸取400μl上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800μl95%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（8）15000rpm离心

7、10min，小心弃掉上清液，加入500μl70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净（9）再加入500μl70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净（10）离心管倒置于37°C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。（11）pMD18-T加入30μl无菌蒸馏水或TE缓冲液；3管pET-his质粒中每管加入10μl蒸馏2水混匀后收集到一个管中，涡旋混合器

8、上混匀，在离心机中瞬时转一下，使溶液集中在管底。待电泳确认（见实验二）后再在pET-his质粒中加入1μlRNaesA。用记号笔标记后放入冰箱中备用。（12）在剩余的菌液中倒入少许84消毒液，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下水池。清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告7．思考®１．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实验中分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。®２．简要叙述酚氯仿