血液线粒体DNA抽提试剂盒说明书.pdf

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1、血液线粒体DNA抽提试剂盒说明书近几年,从有报告暗示糖尿病、阿尔茨海默病和线粒体DNA(mtDNA)变异有关开始,mtDNA分析变得盛行1),2),3),4)。可是，想要抽提高纯度mtDNA，需要繁杂的操作和很多的时间，不适合以多样品处理为目的的研究。目前进行的mtDNA分析，从细胞中抽提totalDNA时，产物中含有微量mtDNA与大量基因组DNA。mtDNA抽提WB试剂盒可短时间从全血中容易的抽提出高纯度mtDNA，适合多样品处理。〔特点〕Ⅰ.简单操作，可短时间（约90分钟）抽提出mtDNA。Ⅱ.可从EDTA处

2、理血及肝素处理血中抽提出mtDNA。Ⅲ.抽提出的mtDNA混入了少量高纯度基因组DNA，可用于限制性内切酶处理或DNA扩增反应。Ⅳ.适合少量多样品的DNA扩增反应的预处理。Ⅴ.不使用苯酚、氯仿等有害剧毒溶剂。〔内容〕1)LeukocyteIsolationSolution5.0ml1支2)DNAExtractionSolutionⅠ26.5ml1支3)DNAExtractionSolutionⅡ(A)1.3ml1支4)DNAExtractionSolutionⅡ(B)1.3ml1支5)DNAExtractionSo

3、lutionⅢ1.9ml1支6)SodiumIodideSolution7.5ml1支7)WashingSolution50.0ml1支〔储存方法〕2～10℃保存〔除试剂盒外，实验所必备的东西〕试剂1)异丙醇（特级，Code166–04836）12.5ml2)TE缓冲液（基因工程学研究，Code316–90025）适量器具1)1.5ml微管（已灭菌）2)涡流搅拌器3)微量高速离心机（最大12,000×g）4)减压干燥机〔使用方法〕(1)将100μl的人类新鲜血液放入微管中*1。*1可使用经EDTA处理的血液及肝素处

4、理的血液，但请勿使用已溶血的血液。(2)加入200μl的LeukocyteIsolationSolution，将微管颠倒10次以上，充分混合*2。*2混合的过程使白血球分离变得容易。(3)把微管静置于室温下15分钟，使成二层分离*3。*3上层有少量红血球浮游，也没有问题。二层不分离的情况，请静置15分钟以上。(4)将含有白血球的上层液用移液管移到新的微管。(5)在室温情况下离心(500×g)10分钟后，使用移液器去除上清液。(6)加入500μl的DNAExtractionSolutionⅠ，经轻敲，颗粒悬浮*4。*

5、4请避免涡流搅拌器等剧烈混合。(7)在室温情况下离心(500×g)10分钟后，使用移液器去除上清液。(8)重复一次步骤(6)及(7)。(9)加入50μl的DNAExtractionSolutionⅠ，经轻敲，颗粒悬浮。(10)50μl的DNAExtractionSolutionⅡ(A)及50μl的DNAExtractionSolutionⅡ(B)*5在另外的微管内混合(用的时候再调配)*6，将100μl这个混合液加入样品中，在涡流搅拌器中进行2～3次轻轻混合搅拌后,放置在冰中5分钟。*5如果DNAExtractio

6、nSolutionⅡ(B)产生沉淀，请用37℃的水，温热完全溶解后，在室温下冷却后使用。*6DNAExtractionSolutionⅡ(A)及(B)混合后，以2～10℃可以保存3周．(11)加入75μl预先冰冷的DNAExtractionSolutionⅢ，用涡流搅拌器混合后，放置在冰中5分钟。(12)以4℃离心(12,000×g)5分钟后，使用移液管将上清液移到新的微管。(约200μl的)*7*7请注意移液管不要吸到沉淀（不需要采取全部上清）。如果吸到茶褐色的沉淀，请再次离心，完全去除沉淀。(13)加入300μ

7、l的SodiumIodideSolution混合。(14)加入500μl的异丙醇混合*8.*8因为异丙醇的品质劣化，液有可能出现黄色着色，所以请使用特级品。(15)在室温情况下离心(12,000×g)10分钟后,去除上清液*9.*9因为含有共沉淀剂，能视为颗粒。(16)加入1ml的WashingSolution混合。(17)在室温情况下离心(12,000×g)5分钟后，去除上清液。(18)重复一次步骤(16)及(17)。(19)颗粒(DNA)减压干燥后，溶解于TE缓冲液中*10.*10最终得到的mtDNA混入了RN

8、A，如要除去，请进行RNase处理（最后浓度为10μg/ml,在室温下反应1小时）。〔故障诊断与解决〕问题原因对策添加LeukocyteIsolation使用已经溶血的血液。不要使用已经溶血的血液。Solution后，液体不分为二层。液体混合不充分。经颠倒搅拌，使液体充分混合。使用的管的内径太大。管内径太大，难分离，请使用1.5ml的微管。DNA扩增反应，D