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1、固体发酵培养南海红树林内生真菌1403#次级代谢产物研究蔡奕彪蔡小玲（中山大学化学与化学工程学院海洋天然产物有机研究所；广东省牛•物功能分子巫点实验室，广东广州510275）摘要：海洋红树林内生真菌次级代谢产物化学结构新颖、种类繁多，是天然药物先导化合物的重要来源。本文对南海红树林内生真菌1403#进行了固体发酵培养，得到醍类等类型的化合物。关键词：红树林内生真菌；次级代谢产物；固体培养海洋多变复杂的环境导致了海洋微生物的多样性。海洋微定物因英特殊的生存环境而具冇产生新型生物活性物质的巨人潜力。近年來，从海洋真菌小分离鉴泄了许多结构新颖的次级代谢产物，这些化合物显示了
2、良好的抗肿癖、抗细菌或抗真菌等生物活件，为新药的开发和各种疑难疾病的治愈提供了新的希望⑴。红树林是一种热带盐滩上特有的植物群落,
3、丸此组成这个群落的几种主耍种类在形态、生理、生态的各个方面都有它的特殊性：丄要表现在胎萌现彖以及根系的多样性屮，以及红树林区经常受到海水的浸淹，土壤屮的含盐量很高（一般在4.6〜27.8%。之间），因而红树植物绝人部分属于盐生植物，具有排除或分泌盐分的结构，能将吸入体内的盐分分别经过茎、叶表面分布的盐腺排出，排在茎、叶表血的盐分晶体被雨水等淋洗掉。如桐花树、海榄雌等植物，就有泌盐的机能,能排除过量的盐分，以适应高盐度的基质卩⑶。在固体发酵屮
4、，菌体可以更高效地利用培养基屮的营养物质，促进次级代谢产物的产生，同时，可能是因为固体发酵更好的模拟了英生活环境，且当菌株附着与固体基质上生长时，供氧丰富，生长密度大，生存竞争更为激烈，因此产生的次级代谢产物的量也会提高。固体发酵还有含水量少，废水、废渣少，环境污染少等优点⑷。醍类化合物（quinonoids）指分子中具有不饱和环二酮结构（酿式结构）或容易转变为这种醛式结构的天然有机化合物。主耍包扌心苯醍、蔡幅、菲醍、蔥胞四类。它是一种色素，在植物中主要存在于蓼科人黄、何首乌、虎杖;茜草科茜草、豆科决明子、番泻叶、百合科芦荟、唇形科丹参、紫草科的紫草等。近年來,随着人
5、们对海洋微生物次级代谢产物研究的深入,一些海洋来源的、结构新颖的且具有良好生物活性的的酿类化合物相继被发现，它们所表现出来的抑菌、抗氧化、诱导细胞凋亡等方面的生物活性比陆生來源的往往婆好很多⑸。1实验部分1.1实验试剂和仪器(1)培养、分离、确定化合物结构所用的葡萄糖为化学纯,蛋白豚(BR),酵母膏(BR),粗海盐(微生物养殖用)，琼脂(BR),英它实验用试剂均为帀伟(AR)试剂。薄层层析是用青岛海洋化工厂生产的硅胶GF254,柱层析硅为青岛海洋化工厂生产的200-300目硅胶，SephadexLH-20葡聚糖凝胶。(2)核磁共振谱用VarianINOVA500NB,
6、BRUKER400NB与300NB核磁仪测/e('HNMR谱500MHzNMR谱125MHz,TMS内标)；HREIMS用VGAutospec-500质谱仪；红外光谱用EQUINOX55-A590/3F(Bruker)红外仪测足；紫外光谱用H本岛津公司的UV-2501PC紫外和"J见吸收光谱测定；元素分析用徳国Elemental*公司的VarioELCHNS-0元素分析仪；熔点用北京X4型显微熔点仪测定(未校正)。AgilentH00型高效液相色谱仪；Waters515HPLC泵；Waters2487双波长检测器；浙江大学N-2000双通道色谱工作站。1.2菌种和菌种
7、的固体培养内生真菌1403#为盐生坚座壳种(HcdoFoselliniasp.)真菌，來自香港红树林树叶内部，由香港城市人学L.L.P.Vrijmoed教授等分离得到，菌种保存在香港城市人学、中山人学和武汉人学中国典型培养物保藏中心内。我们课题组的姜广策、黄华容、夏雪奎三位博士曾对其进行人量液体培养，并对其活性次级代谢产物进行过深入的研究，分出大量的活性强的化合物。本次采用了固体营养基，对1403#内生真菌进行固体发酵，使用PDA固体培养基(1()g蛋白淼、5g酵母膏、iOgNaCK1.5%的琼脂，加dlfcO溶解后,调pH至7.4,d比0定容至IL,115°C,20
8、min高压灭菌)，接种丁•平板上的固体培养基屮，在温度设置在26C培养箱屮培养25天。1.3提取和分离近4升的固体培养棊培养30天后，将固体培养棊切碎，并用甲醉(MO)浸泡一周后，用纱布过滤，分离固体培养皋和菌液，此过程重复3次，培养基晒干，菌液浓缩，再用乙酸乙酯(EA)萃取，EA提取物用适量的200-300目硅胶扌半样，上柱粗分＜=分别用5%,10%,20%,30%,50%,80%,100%的EAPE(石汕醵)淋洗，收集各组分再经反复柱层析，制备薄层层析，重结晶纯化。固体培养慕晒干后，用MO反复浸泡。提取物浓缩后合并，再拌硅胶过人柱，以EAPE
