辣根过氧化物酶.ppt

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1、第三节酶标记物的制备一、酶制剂及其底物作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)活性高(2)性质稳定(3)专一性强(4)酶催化底物的显色信号易于判断和测量(5)方法敏感，重复性好，简单易行(6)酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)HRP比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多个同功

2、酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，PH5左右。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。HRP酶促反应酶促反应的过程：HRPDH2＋H2O2────→D＋2H2O供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD和TMB。另外，还有一种供氢体称ABTS[2,2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，灵敏度和稳定性均好。由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因

3、此酶促反应中使用的H2O2不能过量。HRP常用底物底物产物性质主要吸收峰波长（nm）ABTS绿色水溶性产物410、650OPD邻苯二胺桔黄色水溶性产物492TMB四甲基联苯胺蓝色水溶性产物加入硫酸或磷酸，产生黄色370、652450DAB3.3－二氨基联苯胺不溶性棕色沉淀免疫组化Chloronaphthol产物颜色介于蓝色-蓝紫色，易于成像免疫印迹、免疫组化AEC棕红色沉淀，容易成像多重染色的第二标记碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AP)，AP:系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶，由多个同功酶组成。小牛肠粘膜AP分子量为100kDa，酶作用的最适

4、pH为9.6；大肠杆菌AP分子量为80kDa，最适pH为8.0。AP作用底物较多，常用的酶底物有对硝基本磷酸盐(PNP)、β-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。AP主要用作双标记染色，研究递质共存及酶免疫测定。AP标记抗体，一般采用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。AP常用底物底物产物性质主要吸收峰波长（nm）pNPP对-硝基苯磷酸酯黄色产物----硝基酚405nmNBT不溶性黑紫色沉淀免疫印迹其它：酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、碳酸苷酶、溶菌酶和脲酶作为酶标记对象的抗原与抗体要求：抗原要求纯度高，抗原性完整抗体需要特异性好、效价高、亲合力强

5、以及比活性较高，能批量生产，易纯化。制备方法要求：（1）技术方法简单、产率高，重复性好；（2）标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性；（3）酶标记物稳定，不形成聚合物。二、酶结合物的制备方法方法原理酶标记率直接结合法过碘酸盐氧化法过碘酸盐钠氧化酶分子表面多糖羟基成醛基，与抗体/抗原中游离反应，形成Schiffs碱。70%交联法戊二醛一步法酶和抗体/抗原同时加入戊二醛溶液中，戊二醛两醛基分别与酶及抗体/抗原上氨基反应，生成Schiffs碱1～5%戊二醛二步法酶和抗体/抗原先后分别加入戊二醛溶液中5～25%苯二马来酰亚胺法双功能交联剂PDM通过酶和抗体/抗原中巯基将两者偶联起来高异双功能基团

6、交联法异双功能基团交联剂HECCM分别通过其羟琥珀酰亚胺基和马来酰亚胺基与酶和抗体/抗原上游离氨基和巯基结合85%（一）过碘酸盐氧化法原理：是一种糖蛋白,糖链部分无活性，其己糖邻位-0H可被碱性过碘酸盐氧化成醛基，再与抗体蛋白中游离-NH2形成schiff碱；酶与抗体结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4）还原成稳定的HRP-IgG偶联物。所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和IgG结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。1、HRP标记腹水单抗过碘酸钠氧化法，HRP直接标记腹水中的单抗1、5mgHRP溶解于0.5ml0.1MNaHCO3中；2

7、、加0.5ml10mMNaIO4，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2h；3、加0.75ml0.1MNa2CO3，混匀；4、加0.75ml小鼠腹水单抗，混匀；5、加SephadexG25干粉0.5g，混匀，盖紧，室温作用3h；6、用少许PBS将交联物转移于一支下口具玻璃棉的5ml注射器外筒中；7、用少许PBS将交联物全部洗出；8、收集洗出液，加1/20V新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30min；9、再加3/20VNaBH4溶液，混匀，室温作