辣根过氧化物酶标记

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1、辣根过氧化物酶标记抗体技术及应用进展83100232王伟航实验原理（1）免疫标记技术免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。2（2）辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的原理a.辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HR

2、P）HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm／OD275nm的比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶的纯度。HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生

3、成有色的氧化型染料(D)。HRPDH2＋H2O2────→D＋2H2Ob.辣根过氧化物酶标记方法酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。4在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理论上不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从

4、而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想。用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果，但费用较贵。5四操作步骤（1）称取5mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中。（2）向溶液中加入0.5ml新配的0.1MNaIO４溶液，混匀，4℃静置30分钟。（3）加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀，静置30分钟。（4）加入含5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，pH9.5碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜。6（5）

5、加0.2mL新配的5mg/mLNaBH４液，混匀，再置4℃,2h。（6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h。（7）3000r/min离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/LpH7.4的PBS中。（8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15moL/LpH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。7酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为

6、标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。8由于辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同

7、功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm／OD275nm的比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。9HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)

8、。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:HRPDH2＋H2O2────→D＋2H2O供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应