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1、第29卷第2期河北大学学报(自然科学版)Vol.29No.22009年3月JournalofHebeiUniversity(NaturalScienceEdition)Mar.2009共振光散射测定辣根过氧化物酶李正平,王磊,高瑞广,刘秀贤(河北大学化学与环境科学学院,河北保定071002)摘要:辣根过氧化物酶(HRP)催化H2O2氧化四甲基联苯胺(TMB)生成大分子聚合物并产生强烈的共振光散射,由此建立了操作简单快速、高灵敏度测定HRP的新方法.探讨了酸度、TMB浓度、H2O2浓-7-6度、温度等对散射信号的影响.在
2、最佳实验条件下测定HRP的线性范围为1×10～1×10g/L,最低检-8出限1.8×10g/L.关键词:辣根过氧化物酶;四甲基联苯胺;共振光散射中图分类号:O657.39文献标识码:A文章编号:1000-1565(2009)02-0173-04DeterminationofHRPUsingaRLSTechniqueLIZheng2ping,WANGLei,GAORui2guang,LIUXiu2xian(CollegeofChemistryandEnvironmentalScience,HebeiUniversity,
3、Baoding071002,China)Abstract:AnovelassayfordetectionofHRPusingresonancelightscattering(RLS)hasbeenestab2lished.Themethodisbasedonthat3,3′,5,5′2tetramethylbenzidine(TMB)isoxidizedtoformmacro2moleculepolymerbyH2O2withHRPcatalysis,whichresultsintheintenseRLSsignal.
4、Thisassayissim2ple,rapidandsensitive.Theoptimumanalysisconditionshavebeeninvestigated,includingacidity,thecon2centrationofTMBandH2O2,andreactiontemperature.Thereisagoodlinearrelationshipbetweenthein2-7-6tensityofRLSandtheconcentrationoftheHRPintherangeof1×10～1×1
5、0g/Landthedetection-8limitwas1.8×10g/L.Keywords:horseradishperoxidase(HRP);tetramethylbenzidine(TMB);resonancelightscattering(RLS)近年来,以酶为标记物的酶联免疫分析方法的研究发展迅速,已广泛应用于疾病诊断、病毒鉴定等很多领域.其中辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)是最常用的标记酶之一,它是从辣根中提取的,分子质量为44kDa.HRP能催化过氧化氢(H2O2)
6、氧化某些还原性底物,生成有色物质,以此建立了光学酶[1-6]联免疫和电化学酶联免疫分析法等多种方法.共振光散射技术(resonancelightscattering,RLS)近几年来发展迅速,具有灵敏度高、操作简单的优[7-12]点,已广泛应用于蛋白质、DNA等生物大分子的分析.但利用RLS测定HRP的分析方法尚未见报道.HRP催化H2O2氧化四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)生成自由基,并引发自由基的聚合生成聚收稿日期:2008-10-05基金项目:河北省自然科学基金资助项目(B2006
7、000967)第一作者:李正平(1965-),男,河北易县人,河北大学教授,博士生导师,主要从事分子发光及生化分析研究.©1994-2010ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net·174·河北大学学报(自然科学版)2009年[7]四甲基联苯胺的聚合物.该聚合物是具有共轭结构的大分子,根据RLS理论应具有较强的RLS信号.据此笔者研究了检测HRP的RLS分析方法.1实验部分1.1仪器与试剂F24
8、500荧光分光光度计(日本日立公司);TU21901紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司);WH2861漩涡混合器(江苏太仓市科教器材厂);SZ293自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂).TMB溶液:称取0.0188gTMB(北京欣经科试剂公司)溶于5mL无水乙醇中,用水稀释至10mL,浓-3度为6×10mol/L;H
