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1、第32卷分析化学(FENXIHUAXUE) 研究报告第5期2004年5月ChineseJournalofAnalyticalChemistry647～650荧光素共振光散射法测定脱氧核糖核酸3蔡朝霞 宋功武 李 玲 刘立明(湖北大学化学与材料科学学院,武汉430062)摘 要 研究了咕吨类染料荧光素Fluorescein(FL)与DNA作用的共振光散射光谱。加入DNA后,在pH6～8的范围内,荧光素在DNA分子表面发生长距离自组装,在400nm处产生了增强的共振光散射峰,其发光强度与DNA的浓度呈线性关系,线性范围为0.04～3.1mg/L
2、;检出限为16μg/L。考察了影响因素和最佳反应条件,建立了用RLS光谱测定ng级DNA的新方法。关键词 荧光素,共振光散射技术,脱氧核糖核酸1 引 言染料与核酸的反应机理以及反应产物结构特征的研究,对于了解核酸生物反应历程、临床医学研究及核酸的分析测定均有重要的意义。根据染料与核酸的相互作用建立测定DNA的分析方法已有不少报道,寻求新的简便、灵敏、准确的测定方法仍然是研究的热点。共振光散射法是继光度法和荧光法后1又一简单灵敏的分析方法。Pasternack等用普通荧光分光光度计所建立的共振光散射技术在生物大分子的识别上出现了丰富而灵敏的
3、信号,表征了分子聚集的光谱特征。目前该技术已经应用于痕量药2,345,6物,表面活性剂测定。童沈阳和李克安等在1996年将此技术应用于核酸的分析和研究,从而开辟了光散射技术在生化分析中的应用。荧光素是一种经典的荧光试剂,具有强的荧光,且荧光激发和发射波长均在可见光区,便于检测,应用广泛。有关荧光素与DNA相互作用的研究报告并不多,我们曾研究过荧光素与牛血清白蛋白有相7互作用。本实验利用共振光散射技术研究发现,荧光素与核酸能够相互作用,并且此分析方法快速简便,线性范围宽,灵敏度高,测定干扰小,用于合成样品的测定,结果令人满意。2 实验部分2.
4、1 仪器与试剂GSP277203磁力搅拌器(江苏秦县医疗器械厂);RF2540荧光分光光度计(日本岛津公司);λ217型紫外2可见分光光度计(美国P2E公司);PHB24pH计(上海雷磁仪器厂);WH22微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)。用Tris(三羟甲基氨基甲烷)2HCl缓冲溶液调节pH值,小牛胸腺DNA(ctDNA,华美生物工程公司)-5的操作液浓度为39mg/L,荧光素的操作液浓度为1.0×10mol/L,用0.1mol/L的NaCl水溶液控制离子强度。所用试剂均为分析纯,实验用水均为二次蒸馏水。2.2 实验方法在25mL比色管
5、中依次加入0.2mL荧光素溶液,适量DNA溶液,0.8mLTris2HCl缓冲溶液,用二次蒸馏水稀释至12.5mL,旋涡混合,放置5min。将溶液置于λem=λex处进行同步扫描,可得共振光散射光谱,同时作试剂空白。发射和激发狭缝宽度均为10nm。3 结果与讨论3.1 光谱特征按实验方法测得荧光素2DNA体系的共振光散射光谱(RLS光谱),如图1所示。由图1可以看出,2003203217收稿;2003212222接受本文系中国分析测试基金资助项目(No.99211)648分析化学第32卷荧光素本身的RLS信号在400nm处并不强,但是加入D
6、NA后,400nm处出现了增强的共振光散射峰。其主要原因归结于荧光素在DNA表面分子上8的长距自组装。按照实验方法考察了荧光素2DNA体系的紫外2可见吸收光谱。在200～240nm附近出现了一宽阔峰。随DNA浓度的增大,荧光素2DNA体系在230nm处的吸收峰下降,并发生减色效应,其原因是由于荧光素在DNA分子表面的聚集。当DNA的浓度继续增大,吸收峰又开始增大。说明随DNA浓度的 图1 共振光散射谱升高,荧光素与DNA的作用经历了由聚集到嵌入的Fig.1Resonancelight2scattering(RLS)spectra8变化。1.
7、fluorescein(FL)+deoxyribonucleicacid(DNA);2.FL。浓3.2 条件的优化-7度(concentration):FL1.6×10mol/L;DNA:1.0.624mg/L;3.2.1溶液酸度的影响 按实验方法,以Tris2HCl缓冲2.0.0mg/L;pH=7.5。溶液调节溶液的pH,测定不同酸度下的荧光素和荧光素2DNA体系的RLS强度。其结果如图3。由图可知,荧光素RLS强度随溶液酸度变化很小。而加入DNA后,体系RLS信号增强,并且随着酸度变化,差值也在变化。当pH值在6～8范围时,体系RLS强
8、度达到最大且保持稳定,其原因是在中性条件下,DNA的结构没有被破坏所致,本实验选择pH值为7.5。 图2pH值对共振光散射强度的影响 图3 变性DNA和天然DNA对体系RLS强度
