辣根过氧化物酶的新型包埋及其性能分析

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1、浙江大学硕士学位论文摘要摘要本文阐述了一种酶蛋白质分子的新型包埋方法：在酶的包埋过程中，首先，采用了化学修饰的方法，在酶表面引入不饱和键；其次，修饰酶-9含双键单体进行自由基聚合，对酶实施共价包埋，使得酶与载体形成了多点连接。文中重点讨论了包埋酶的制备过程、包埋酶在水溶液中的催化性能以及化学因素对其催化活性的影响。包埋酶制备过程：本文以N．丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)为修饰剂，通过其与酶上的氨基反应，对辣根过氧化物酶(HRP)进行化学修饰；然后在修饰酶中加入聚乙二醇400(200)二(甲基)丙烯酸酯和丙烯酰胺作为聚合原料，通过加入自由基引发剂引发聚合反应，获得了4种新

2、型包埋的辣根过氧化物酶。实验结果表明，当HRP与NAS摩尔比约为l：20000，修饰时间为1h时，辣根过氧化物酶分子侧链修饰结果最佳；自由基聚合采用最佳原料配比为：辣根过氧化物酶液10ml，丙烯酰胺50mg，单体59，其中单体分别为聚L--醇400二丙烯酸酯(单体A)、聚乙二醇400二甲基丙烯酸酯(单体B)、聚乙二醇200二丙烯酸酯(单体C)、聚乙二醇200二甲基丙烯酸酯(单体D)．本文对包埋酶在水溶液中的催化性能进行了研究，实验结果表明：四种包埋辣根过氧化物酶A．HRP、B．HRP、C．HRP和D．HRP的相对活性分别为107．8％，47．1％、104．3％和23．3

3、％；在高温80。C时，四种包埋酶活性都有所保留，其中A．HRP保留的活性最高为42．1％，而此温度下游离酶几乎完全失活；当包埋酶C．HRP重复使用5次后，仍保留62．1％的初始活性；在4"C下储存30天后，包埋酶A．HRP活性几乎没有下降，而游离酶液活性下降了62％，储存75天后，A．HRP活性仍为原来的55．7％，而游离酶液在储存50天后出现菌落，蛋白质变质。实验中还考察了化学因素对辣根过氧化物酶催化性能的影响。在强酸(pH=3．0)条件下，游离HRP相对活性低于8％，而包埋酶C．HRP相对活性为47．9％；在强碱(pH=11．0)条件下，游离HRP相对活性为13．8

4、％，而C．HRP相对活性为39．7％；游离酶液最适pH范围在5．0～7．0，当pH>7时，其活性急剧lIl浙江大学硕士学位论文摘要下降，而当pH>7时，包埋酶C．HRP仍然保留较高的活性。在金属离子溶液中，随着金属离子价态升高，HRP活性呈下降趋势。室温25。C下，用0．5％SDS浸泡30d后，四种包埋酶催化活性仍然有36％以上；用6mol／L脲浸泡30d后，A．HRP催化活性仍有62．7％。在有机溶剂体系的酶催化反应中，随着有机溶剂疏水参数logP的增加，HRP的催化活性增大，当采用异辛烷(109P=4．5)时，酶的催化活性达到最大。关键词：辣根过氧化物酶，化学修饰，

5、自由基聚合，包埋，催化性能浙江大学硕士学位论文AbstractAbstractAnovelencapsulatedenzymeisdescribedbythisdissertation．First，theenzymewaschemicallymodifiedtogetunsaturateddoublebonds；thentheradicalpolymerizationwashappenedbetweenthemodifiedenzymeandthemonomerwhichalsocontainunsaturateddoublebonds；finally,encapsul

6、atedenzymeWasobtainedandtheenzymewasmultipointconnectedtothecarder．Thenthepreparationprocessandthecatalyticpropertiesinaqueoussolutionoftheencapsulatedenzymewereinvestigated，theinfluenceofthecatalyticpropertiesbychemicalfactorsWasalsostudied．Thefirstpartofthisthesisexplorestheprocessofen

7、capsulatedhorseradishperoxidase(HRP)．AminogroupsofHRPwasmodifiedbythemodifierN-acryloxysuccinimide(NAS)．ThemodifiedHRPWasaddedintoacopolymersystem，whichcontainedfourdifferentkindsofPEG400(200)-di(meth)acrylateesterandacrylamide．Thepolymerizationwasinitiatedbyfreeradicals．