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1、XX大学毕业论文褪黑素对AB诱导的大鼠脑组织GFAP和S100B蛋白表达的干预作用姓名：2014年6月25日褪黑素对Ap诱导的大鼠脑组织GFAP和S100P蛋白表达的干预作用作者：周军侯徳仁曾庆仁陈坤周丽万顺出怡【摘要】H的观察褪黑素(MT)干预p淀粉样蛋白(A卩)诱导的人鼠脑组织胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S1OOP蛋白的表达，探讨MT对老年痴呆症(AD)治疗的作用机制。方法30A大鼠随机分为生理盐水对照组、卩淀粉样蛋白(A0)诱导AD模型构建组(模型组)和AD模型+MT治疗组(MT组)。动物喂养40d时取大鼠脑组织，用HE染色观察脑组织病理变化，免疫组化染色
2、法检测A卩标记的脑组织部位以及A卩对神经细胞毒性作用，同时检测胶质细胞的GFAP和S100卩蛋白的表达水平。结果HE染色观察脑组织病变在MT组明显轻于模型组;免疫组化结果显示，Ap的表达水平在模型组和MT组二者间无明显差界，但A卩对海马CA3区神经元损伤作用在模型组要大于MT组。GFAP和S100P表达水平在模型组则显著高于MT组和正常组(P0.05)。结论用MT干预治疗，可降低AD模型鼠胶质细胞表达GFAP和S100P蛋白的水平，从而起到了减轻人脑神经元细胞的损伤作用。【关键词】褪黑素；老年痴呆症;卩淀粉样蛋白;星形胶质细胞阿尔茨海默病(AD)是一种常见的老年痴
3、呆症，主要表现为认知能力丧失以及神经病理性结构损伤，包括脑组织萎缩、老年斑和神经纤维缠结与大量的卩淀粉样蛋白(A
4、3)沉积。AD是威胁老年群体健康与寿命的最重要的疾病之一(1),H前尚无有效治疗方法，因此深入开展对AD发病机制研究和寻找有效治疗方法具有重要意义。研究证明年龄老化和脑组织屮AP沉积是促使AD发生发展的主要原因，与机体氧自由基产生增加、清除氧自由基能力下降等因素有关(2〕。神经胶质细胞构成屮枢神经系统微环境，活化后可分泌大量细胞因子，释放氧自由基、激活补体，启动免疫反应，在AD的病变屮起重要作用。褪黑索(MT)是一种重耍的抗衰老激素，可有效地防止大脑功
5、能退化，减少与年龄相关的炎症基因表达增长，并诱导抗氧化的基因生成;能通过血脑屏障，且价廉又无明显毒副作用（3〕。考虑到MT具有巨大的潜在效应，故有可能成为一种极好的用于研究治疗AD疾病的化合物。本实验在观察A卩所引起神经毒作用的同吋，重点探索MT干预A卩诱导大鼠脑组织表达GFAP和S100P两种蛋白水平的影响，以了解MT在AP沉积在脑组织所发挥的作用，为治疗AD提供实验依据。1材料与方法1.1纤维型A卩1〜42的制备取0・5gA卩1〜42（美国Sigma公司）溶于250卩1注射用生理盐水屮，用电动混悬器充分混匀，置于37C恒温箱屮孵育1w,使其成为聚集状态的纤维型
6、A卩1〜42,置4C冰箱屮备用。1.2动物分组及模型制备成年SD雄性大鼠30只，体重180〜220g,由屮南大学湘雅医学院实验动物屮心提供，其屮随机取20只建立AD模型，10只作为正常对照组。建模方法：将SD大鼠用10%水合氯醛（0.35mg/kg）麻醉后置于立体定位仪上，切开皮肤，找到前冈所在位置，参考大鼠图谱确定前囱后3.0mm,屮线旁2.0mm为海马的所在的体表投影位置，以牙科钻钻开--骨窗，将微量注射器固定在立体定位仪上，进针约2.8mm,缓慢均匀注入纤维型A
7、31〜42溶液10gg/5gl,5min注射完毕，留针5min,然后缓慢撤针，术后缝合皮肤。对照
8、组按照模型制备的全过程在脑内注射生理盐水5pl。建模成功后随机分为模型组和MT用药组，与正常组均平行给予常规饮食及正常活动。模型组和对照组均灌胃1ml生理盐水,MT用药组用褪黑索0.15mg/kg（生理盐水配制）灌胃，每次1ml/d,持续40do1.3脑组织切片的制备模型建立40d后，将对照组、MT组和模型组三组人鼠用10%水合氯醛（0.35mg/kg）麻醉，暴露心脏，经左心室灌注0.01mol/LPBS,待大鼠的肝脏颜色变浅，然后改以4%的多聚甲醛灌注，流速约为lOml/mim并取脑组织置于4%多聚甲醛溶液屮冰箱后固定过夜，次日用0.01mol/LPBS反复浸洗
9、，最后将脑组织梯度酒精脱水，透明，石蜡包埋，冠状切片（厚约5呵）备用。1.4免疫组织化学主要试剂和实验方法取脱蜡切片入PBS缓冲液，经抗原修复液（美国Vector,H3300）80°C存放20min,待自然冷却后，缓冲液清洗2次，再入3%H2O2室温下5min,以消除内源性过氧化物酶。然后，切片孵育在2%小牛血清屮1h,以减少组织非特异性反应。实验屮所用抗体6E10购于美国Covance公司（产詁编号：S1G39340,1:1000）;NeuN购于Chemicon公司（产品编号：MAB377,1:1000）;S100卩购于Sigma,产品编号：S2657,1:10
10、0）,GF
