褪黑素对aβ诱导的大鼠脑组织gfap和s100β蛋白表达的干预作用

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1、褪黑素对Aβ诱导的大鼠脑组织GFAP和S100β蛋白表达的干预作用：周军侯德仁曾庆仁陈坤周丽万顺田怡【摘要】目的观察褪黑素(MT)干预β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的大鼠脑组织胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S100β蛋白的表达，探讨MT对老年痴呆症(AD)治疗的作用机制。方法30只大鼠随机分为生理盐水对照组、β淀粉样蛋白(Aβ)诱导AD模型构建组(模型组)和AD模型+MT治疗组(MT组)。动物喂养40d时取大鼠脑组织，用HE染色观察脑组织病理变化，免疫组化染色法检测Aβ标记的脑组织部位以及Aβ对神经细胞毒性作用，同时检测胶质细胞的GFAP和S100β蛋白的表达

2、水平。结果HE染色观察脑组织病变在MT组明显轻于模型组;免疫组化结果显示，Aβ的表达水平在模型组和MT组二者间无明显差异，但Aβ对海马CA3区神经元损伤作用在模型组要大于MT组。GFAP和S100β表达水平在模型组则显著高于MT组和正常组(P<0.05)。结论用MT干预治疗，可降低AD模型鼠胶质细胞表达GFAP和S100β蛋白的水平，从而起到了减轻大脑神经元细胞的损伤作用。【关键词】褪黑素;老年痴呆症;β淀粉样蛋白;星形胶质细胞　阿尔茨海默病(AD)是一种常见的老年痴呆症，主要表现为认知能力丧失以及神经病理性结构损伤,包括脑组织萎缩、老年斑和神经纤

3、维缠结与大量的β淀粉样蛋白(Aβ)沉积。AD是威胁老年群体健康与寿命的最重要的疾病之一〔1〕，目前尚无有效治疗方法，因此深入开展对AD发病机制研究和寻找有效治疗方法具有重要意义。研究证明年龄老化和脑组织中Aβ沉积是促使AD发生发展的主要原因，与机体氧自由基产生增加、清除氧自由基能力下降等因素有关〔2〕。神经胶质细胞构成中枢神经系统微环境，活化后可分泌大量细胞因子，释放氧自由基、激活补体，启动免疫反应，在AD的病变中起重要作用。褪黑素(MT)是一种重要的抗衰老激素，可有效地防止大脑功能退化，减少与年龄相关的炎症基因表达增长，并诱导抗氧化的基因生成;能通过血

4、脑屏障，且价廉又无明显毒副作用〔3〕。考虑到MT具有巨大的潜在效应，故有可能成为一种极好的用于研究治疗AD疾病的化合物。本实验在观察Aβ所引起神经毒作用的同时，重点探索MT干预Aβ诱导大鼠脑组织表达GFAP和S100β两种蛋白水平的影响，以了解MT在Aβ沉积在脑组织所发挥的作用，为治疗AD提供实验依据。　　1材料与方法　　1.1纤维型Aβ1～42的制备取0.5gAβ1～42(美国Sigma公司)溶于250μl注射用生理盐水中，用电动混悬器充分混匀，置于37℃恒温箱中孵育1g/kg)麻醉后置于立体定位仪上，切开皮肤，找到前囟所在位置，参考大鼠图谱确定前囟后3

5、.0mm，中线旁2.0mm为海马的所在的体表投影位置，以牙科钻钻开一骨窗，将微量注射器固定在立体定位仪上，进针约2.8mm，缓慢均匀注入纤维型Aβ1～42溶液10μg/5μl,5min注射完毕，留针5min，然后缓慢撤针，术后缝合皮肤。对照组按照模型制备的全过程在脑内注射生理盐水5μ1。建模成功后随机分为模型组和MT用药组，与正常组均平行给予常规饮食及正常活动。模型组和对照组均灌胃1ml生理盐水，MT用药组用褪黑素0.15mg/kg(生理盐水配制)灌胃，每次1ml/d，持续40d。　　1.3脑组织切片的制备模型建立40d后，将对照组、MT组和模型组三组大鼠

6、用10%水合氯醛(0.35mg/kg)麻醉，暴露心脏，经左心室灌注0.01mol/LPBS，待大鼠的肝脏颜色变浅，然后改以4%的多聚甲醛灌注，流速约为10ml/min，并取脑组织置于4%多聚甲醛溶液中冰箱后固定过夜，次日用0.01mol/LPBS反复浸洗，最后将脑组织梯度酒精脱水，透明，石蜡包埋，冠状切片(厚约5μm)备用。　　1.4免疫组织化学主要试剂和实验方法取脱蜡切片入PBS缓冲液，经抗原修复液(美国Vector，H3300)80℃存放20min，待自然冷却后，缓冲液清洗2次，再入3%H2O2室温下5min，以消除内源性过氧化物酶。然后，切片孵育在

7、2%小牛血清中1h，以减少组织非特异性反应。实验中所用抗体6E10购于美国Covance公司(产品编号：SIG39340，1∶1000);NeuN购于Chemicon公司(产品编号：MAB377，1∶1000);S100β购于Sigma，产品编号：S2657，1∶100),GFAP购于美国DAKO公司(Z0334，1∶1000)。切片分别在1%小牛血清与0.1%Triton和上述抗体的混合液中4℃冰箱孵育过夜，次日经缓冲液洗涤3次后,加相应二抗(1∶400)溶液，室温孵育1h，缓冲液洗涤3次后，加生物素与卵白素结合(ABC)试剂盒配置的混合液中再孵育

8、1h。底物呈色反应采用DAB试剂盒。所有二抗、ABC和DAB试剂盒