细胞培养地基本方法.doc

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1、第三章细胞培养的基本方法第一节培养细胞的细胞生物学一、基本概念通常，体外培养的生物成分无外乎两种结构形式：其一是小块组织或称为组织块（tissueblock），一般称为外植块；其二是将生物组织分散后制成的单个细胞，一般称为分离的细胞(isolatedcell)或者分散的细胞(dissociatedcell)。分散的过程通常在培养液或平衡盐溶液中进行，分散的细胞被悬浮于培养液或平衡盐溶液中。单个细胞分散存在于培养液或其它平衡盐溶液中、缓冲溶液中，就称为细胞悬液(cellsuspension)。狭义的细胞

2、培养(cellculture)主要是指分离（散）细胞培养，广义的细胞培养的概念还包括单（个）细胞培养(singlecellculture)。一种是群体培养（massculture），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层；另一种是克隆培养（clonalculture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖

3、先细胞。现今，用于疫苗生产的细胞基本有3类，即原代细胞、二倍体细胞株及传代细胞系。经过几十年的研究和发展，目前我国已经拥有了可以进行大规模疫苗生产的动物原代细胞、二倍体细胞和Vero细胞等生产技术，用于生产多种人用、动物疫苗。其中二倍体细胞（如我国70年代建立的人胚肺二倍体细胞株KMB17和2BS）对多种病毒具有广泛的敏感性，用其制备病毒性疫苗可以克服使用原代细胞时在其培养物中可能存在的各种潜在致病因子的危险，是当前病毒性疫苗生产较为理想的细胞基质。Vero细胞是1962年由日本Chiba大学的Yas

4、umura等人从成年非洲绿猴肾中分离获得的，是一种贴壁依赖性成纤维细胞，核型为2n60，高倍体率约为1.7%，可持续地进行培养，不含任何污染因子。通常使用199培养基添加5%胎牛血清进行培养。该细胞可用于多种病毒的增殖，已被WHO批准广泛用于人用、动物用疫苗生产。二、体外培养细胞的分型（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，大致分成以下四型：1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、

5、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。4、多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和

6、稳定的形态，可统归于此类。（二）悬浮型:见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。三、培养细胞的生长和增殖过程:体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。另外，很多细胞在体外的生存

7、也不是无限的，存在着一个发展过程。所有这一切，使组织细胞在培养中有着一系列与体内不同的生存特点。（一）培养细胞生命期（LifeSpanofCultureCells）:所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维待一年左右的生存时间，最后衰老凋亡（Apoptosis）。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；如培养的为其它细胞,如

8、肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞全生存过程中，大致都经历以下三个阶段：1．原代培养（PrimaryCulture）期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的