用Protein A亲和层析法快速分离纯化鲫血清IgM方法的建立和应用.pdf

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1、第25卷第3期2010年6月大连海洋大学学报JOURNALOFDAUANOCEANUNIVERSrIYV01．25No．3Jun．20l0文章编号：1000-9957(2010]03-0233一05用ProteinA亲和层析法快速分离纯化鲫血清IgM方法的建立和应用吴光辉1’2，王庆1，巩华1，石存斌1，李华2，吴淑勤1(1．中国水产科学研究院珠江水产研究所。广东广州510380；2．大连海洋大学生命科学与技术学院，辽宁大连116023)摘要：采用ProteinA亲和层析法对鲫Carassiusauratus血清中的IgM进行快速

2、分离纯化，所得产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAcE)和免疫印迹(Westernblotting)进行分析检测。结果表明：采用ProteinA亲和层析法可以很好地分离到高纯度的鲫血清IsM，电泳条带中重链和轻链清晰可辨，重链、轻链的相对分子质量分别为85000、25000左右，无明显杂带；利用纯化的鲫血清IgM免疫小鼠，获得了高效价抗IsM抗血清，可以特异性识别鲫血清和黏液中IsM重链。应用间接ELISA方法对浸泡免疫后的鲫血清和皮肤黏液中抗体的动态进行检测，结果显示：鲫皮肤黏液中的抗体滴度在免疫后第6天达到峰值，血清中抗体滴

3、度在免疫后第15天达到峰值，前者高峰期出现较早，但持续时间短，后者高峰期出现较晚，但持续时间较长。本试验中所建立的PmtienA亲和层析法为鱼类抗体制备、病原检测及免疫学相关研究提供了一种便捷的方法。关键词：鲫；ProteinA；IgM；纯化；抗体检测中图分类号：Q595文献标志码：A大量研究证明，鱼类在受到外来病原入侵时，能够发生体液免疫和细胞免疫，其中，免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)在鱼类特异性体液免疫应答中起着主要作用。已经报道的鱼类免疫球蛋白有IgM、IgD、Igz和IgT4种类型，不过，只有IgM被证明

4、在免疫反应中发挥作用⋯。高纯度的鱼类血清IgM在鱼类免疫学中用途非常广泛，如制备单克隆抗体、多克隆抗体、检测鱼类免疫应答水平及鱼类病原体，探索鱼类免疫系统的进化等。ELISA方法是目前检测动物特异性抗体水平的主要手段。魏鉴腾等比1和罗霞等旧1用ELISA方法分别检测了大菱鲆和鳜的特异性抗体水平。对鱼体特异性抗体的检测对于病害的流行状态监测、病原检测以及疫苗免疫效果评价具有重要作用。因此，如何快速纯化鱼类IgM，制备相应抗体是进行血清学试验的前提。鱼类血清IgM的纯化方法主要有盐析、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析和亲和层析

5、等。目前国内外学者用不同的方法从鲈【．J、欧洲鳗【5】、大黄鱼【6J、鸟鳢¨】、斑点叉尾鲷【sJ、青石斑鱼【91等鱼类血清中成功纯化了M型免疫球蛋白(IgM)。本试验中，作者采用ProteinA亲和层析的方法对鲫Carassiusauratus血清IgM进行分离纯化，通过SDS—PAGE和Western—blotting技术对纯化蛋白的部分特性进行分析。利用纯化的血清免疫小鼠，获得了高效价抗IgM的抗血清，并应用间接ELISA方法检测了免疫后鲫血清和黏液的抗体滴度变化，初步建立了一套方便、快捷的适合实验室小规模蛋白纯化的方法，以期

6、为抗体制备、病原检测及鱼类免疫学等试验提供技术支撑。1材料与方法1．1材料试验用鲫(100尾)取自广州市南海某养殖场，体重为100—200g。将试验鲫在鱼缸中恒温暂养7d，水温为28℃。ProteinAAgamse购自美津生物公司，其它试收稿日期：2009—09—21基金项目：国家“863”计划项目(2006从1003∞)；农业公益性行业科研专项(200803013)作者简介：吴光辉(1981一)，男，硕士。E—mail：yaredai999@163．com通信作者：吴淑勤，女，研究员。E—mail：wushuqin001@210

7、n．corn234大连海洋大学学报第25卷剂均为国产分析纯。1．2方法1．2．1疫苗的制备和免疫方法哈维氏弧菌Sp．GY020601株由珠江水产研究所鱼病室自行分离、鉴定。将菌种接种到TSA固体培养基上，28℃下过夜培养，再转接到TSB液体培养基中，28℃下摇床培养过夜。将培养好的菌液经体积分数为0．3％的福尔马林灭活后，制成全菌灭活疫苗。调至终浓度为107CFU／mL。将试验鱼随机分为两组，免疫组和对照组，每组50尾。免疫组鲫经全菌疫苗浸泡免疫30min，对照组鲫于体积分数为0．65％的生理盐水中浸泡30min。7d后用同样方法

8、加强免疫一次。1．2．2鲫血清IgM的纯化对未免疫的鲫及免疫后的鲫于尾静脉处取血，凝血后于4℃条件下收集血清。取ProteinAAgarose100斗L加入1．5mL离心管中，4℃下离心(×500g)lmin，弃上清液。再用同样方式用PBS洗涤3遍