血清γ球蛋白分离、纯化及鉴定综合实验建立及探析

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1、血清Y球蛋白分离、纯化及鉴定综合实验建立及探析【关键词】综合实验生物化学Y球蛋白生物化学是研究生物体内化学分子与化学反应的科学，从分子水平探讨生命现象的本质［1］。生物化学基本理论的建立、完善和发展是以实验研究为基础［2］。而要完成开发学生的潜能，培养学生的创新精神和创新能力，培养大学生的综合素质这一任务的重要手段是在开设的综合实验中得以实现的［3］。我们依据最新教学大纲，结合实验室现有的条件，对原有实验内容进行了重新整合，力争即有保留又有创新，设计了规模较大的综合实验“血清V球蛋白的分离、纯化与鉴定”。经过反复实验

2、预试，并经过一年（两学期）医学本科学生的实验教学证明，实验方法稳定，结果重复可靠，便于学生操作，教学效果良好。1材料与方法1.1仪器与材料1.1.1仪器KDC40低速离心机、1.5cmX20cm玻璃层析柱、722可见分光光度计、DYY2C电泳仪及DYCZ24D型垂直板电泳槽均为国产。1.1.2试剂材料新鲜猪血清、pH7.0饱和硫酸铁溶液、0.01mol/LpH7.0PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)、葡聚糖凝胶G25(SephadexG25)、奈氏(Nessler)试剂、20%(W/V)磺基水杨酸溶液、pH8.6离子强度0

3、.06巴比妥缓冲液、氨基黑10B、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS(十二烷基硫酸钠)考马斯亮蓝R250、甘氨酸、Tris、BSA(牛血清白蛋白)等除SephadexG25(SWEDEN进口分装)外均为国产。1.2方法取新鲜血清2ml,加入等量PBS和饱和硫酸铁溶液，混匀后静止30min,3000rpm离心lOmin,沉淀物即是Y球蛋白。该步骤可重复12次，以保证纯度。将V球蛋白通过SephadexG25层析作用，用PBS洗脱，除去蛋白质中的小分子鞍盐，从而达到Y球蛋白纯化的目的。洗脱下来的收集液可以用磺基水杨酸检测蛋

4、白质的存在，用奈氏试剂检测是否除净NH4+,然后把含有V球蛋白的样品合并收集。把纯化的Y球蛋白与正常猪血清样品进行醋酸纤维素膜电泳作对照验证。把纯化的V球蛋白、正常猪血清样品用双缩脉试剂显色后，用分光光度法测定其含量，并稀释成加g/mlo把纯化的Y球蛋白、正常猪血清及标准蛋白(2mg/ml)分别用含疏基乙醇的样品缓冲液处理，用12%分离胶进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)[4],作进一步对照验证。2结果2.1醋酸纤维素膜电泳纯化的Y球蛋白样品为一条带（V球蛋白位置）；正常猪血清样品为五条带（清蛋白、Q1、

5、Q2、B及Y球蛋白）2.2SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳正常猪血清样品出现十几条带，在清蛋白前面出现二条带且与纯化的Y球蛋白样品出现的二条带相平行。标准蛋白为纯一条带且与正常猪血清样品的清蛋白相平行，而纯化的Y球蛋白样品无明显清蛋白，其它蛋白带与正常猪血清样品相比较颜色对应变浅。3讨论3.1目的原理血清中的丫球蛋白是一类结构相似具有重要免疫功能的多种蛋白质，它们的分子量多数在150KDa左右，基本结构由两条分子量相同的轻链（H链23KDa）和两条分子量相同的重链（L链55KDa）通过二硫键连接组成。分离、纯化与鉴定Y球蛋白

6、的方法很多，从设计的生化实验目的考虑，选用硫酸铁盐析分离、葡聚糖凝胶纯化V球蛋白，不仅保证其相对纯度，节省时间，更重要的是保证其完好的生物学活性。而用醋酸纤维素膜电泳和SDSPAGE,对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定，是较为经济、快速且可重复的方法，尤其是SDSPAGE,已成为许多研究领域广为应用的重要分析技术。我们把纯化的V球蛋白、正常猪血清及标准蛋白用含有蔬基乙醇的样品缓冲液处理后进行SDSPAGE,可使纯化的V球蛋白、正常猪血清中的V球蛋白还原成两条分子量相同的轻链和两条分子量相同的重链而出现二条带，且相互平行

7、；而标准蛋白不含二硫键，不能解链，故只出现一条带且与正常猪血清中的清蛋白相平行。至于纯化的Y球蛋白样品除Y球蛋白解链为重轻链后的其它蛋白在盐析时已分离出大部分，经高灵敏度的SDSPAGE仍可不同层度的显现出浅带。3.2体会实验样品来源为猪血清，取材方便易得，同时节约了样品的用量，本实验只需1份（每1个小组）2inl血清样品即可满足所需；节省了实验经费的支出；对环境无污染;而标准蛋白采用单一成分为国产牛白蛋白（67KDa）,价格低而且电泳成带清晰整齐，尤其适合教学。结构安排合理，难易适度，精简了教学时数。综合实验共用1

8、6学时，分二次完成。第一次8学时，血清V球蛋白的分离、纯化与鉴定（一），完成血清Y球蛋白的分离、纯化及醋酸纤维素膜电泳；第二次8学时，血清V球蛋白的分离、纯化与鉴定（二），完成Y球蛋白、正常猪血清样品的定量和SDSPAGE,在时间上至少节省8学时。在学生实验操作上，从刻度细管，可调玻璃加液器的使用到微量进样器，可调式移液器选用；从免疫抗体的分离