血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定

《血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、实验三血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定层析技术（Chromatography)层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。用色彩（chroma）和图谱（graphs）组成色谱一词（Chromatography)层析技术（Chromatography)依据：混合物中各组分的理化性质差异—吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数。基

2、本原理固定相—固定不动流动相—对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。分类①流动相的物理状态：气相和液相→气固/液，液固/液②操作方式：纸、薄层、柱③分离原理：吸附、分配、凝胶、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相凝胶层析(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析)定义：指混合物随流动

3、相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。基本原理：固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。流动相：洗脱液凝胶层析的基本原理交联葡聚糖凝胶其商品名为SephadexG系列G—交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200八种，具体含义为凝胶得水值的10倍或吸水量（g）/10g干胶。交联度与孔径大小成反比：交联度越

4、大，孔径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。影响因素*层析柱的选择及装填：柱大小—分离样品量凝胶型号—分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子*洗脱液：溶解待分离物质，不变性*加样量：1%～5%*凝胶的再生蛋白质的分离依据生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析蛋白质的胶体性质：稳定因素为水化膜和电荷→盐析/有机溶剂沉淀两性电解质和等电点：pH>pI，蛋白质带负电；反之带正电→电泳、离子

5、交换层析有一定的功能：抗原性→免疫沉淀、亲和层析血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定清蛋白pI=4.957%～72%α12%～5%α2pI<64%～9%β6.5%～12%γpI=7.32%～20%球蛋白血清实验思路分段盐析去除杂蛋白凝胶层析脱盐交联葡聚糖吸水浓缩醋酸纤维素薄膜电泳鉴定上午完成下午完成先粗后细鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳COO-COO-COOH╱+H+╱+H+╱PrPrPr╲+OH-╲+OH-╲NH2NH3+NH3+pH>pIpH=pIpH

6、维素薄膜电泳介质：醋酸纤维素薄膜，纤维素的羟基经乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。溶于有机溶剂后涂成薄膜，具均一的泡沫状结构，有强渗透性。电泳缓冲液：pH8.6的巴比妥缓冲液鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳清蛋白pI=4.957%～72%α12%～5%α2pI<64%～9%β6.5%～12%γpI=7.32%～20%球蛋白清蛋白12加样线加样线纯化蛋白对照样品鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳【操作步骤】1．点样：取经巴比妥缓冲液浸透的2×8cm薄膜，滤纸吸去表面多余水分，在无光泽面距一端2cm处用铅笔

7、划一加样线，写上编号。小滤纸片蘸取血清/样品，垂直压在加样线上，待样品渗入薄膜，无光泽面向下平贴在电泳槽支架的盐桥上，静置5～10分钟平衡。点样端置阴极，盖上盖子。2．通电：接通电源，调节电压为40～50V，通电2～2.5h，关闭电源，停止电泳。3．染色：薄膜浸入氨基黑B染色液2～5分钟。4．漂洗：取出薄膜在漂洗液中漂洗4～5次，至无蛋白区完全脱色为止。取出，用滤纸吸干液体。观察。+铅笔标记，垂直点样保持膜不下垂半干燥态凝胶型号颗粒大小（μm)溶胀体积(ml/g)分离范围（Mr）G-1040～12

8、02～3＜7×102G-1550～1502.5～3.5＜1.5×103G-2550～1504～61×103～5×103G-5040～1209～111.5×103～3×104G-7540～12012～153×103～8×104G-10040～12015～204×103～1×105交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数长链状葡聚糖分子间以环氧丙烷连接分段盐析分段盐析：各种蛋白大小、亲水程度、pI不同，所需的盐浓度、pH也不一样。如清蛋白分子小，亲水性强，需高盐浓度才沉淀，球蛋白分子大，亲