血清γ—球蛋白的分离与纯化讲义

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1、实验血清γ—球蛋白的分离与纯化蛋白质是重要的生物大分子之一。在生物材料常以混合物状态存在，因此掌握蛋白质的分离、纯化与鉴定的基本原理，掌握有关的技术操作(本实验重点掌握柱层析技术)，无疑对蛋白质化学及其生物学功能的研究是十分重要的。常用于分离蛋白质的方法有盐析、柱层析。超离心，超滤和电泳等等。根据目的要求不同，可分别采用或几种方法配合使用。本实验以分离血清中γ球蛋白为例，介绍蛋白质的分离、纯化与鉴定过程，其中包括盐析，离子交换、浓缩和电泳几个步骤。盐析法——半饱和硫酸铵溶液沉淀γ-球蛋白[实验原理]不同的蛋白质，其生物学和理化学性

2、质如分子大小、溶解度、等电点，吸附性质及其对其他分子(配基)的亲和力等都不相同。利用这些差异，可分离提纯各种蛋白质。血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白，α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。其中γ-球蛋白含量约占16%，100m1血清中约为1.2g左右。可利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐类溶液中(常用的有硫酸铵、硫酸钠)溶解度的差异而进行沉淀分离，此法称为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心而分离。沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。凝胶层折法——去除γ-球蛋白的粗制品中

3、的盐用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化。因此必须占先去除。常用的方法有透析法、凝胶层折法等。本实验采用凝胶层折法，其原理是利用蛋白质与无机盐类之问分子量的差异。当溶液通过SephadexG-50凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中。因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。阴离子交换层折法——DEAE纤维素纯化γ-球蛋白脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。α-球蛋白，β-球

4、蛋白的pI<6.0；γ-球蛋白的pI为7.2左右。因此在pH6.3的缓冲液中，各类球蛋白所带电荷不同。经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的球蛋白和能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的γ-球蛋白则不能与DF-hE纤维紊进行交换结合而直接从层析柱流出，因此随洗脱液流出只有球蛋白，从而使γ-球蛋白粗制品被纯化。其反应式如下：COO—α-COOHCOOHα-β-球蛋白pH6.3β-球蛋白pH6.3γ-球蛋白NH2γ-NH2NH3+C2H5纤维素-O-（CH2）2-N(C2H5)2pH6.

5、3纤维素-O-（CH2）2-+N-H2PO4—H++H2PO4—C2H5H+C2H5COO—纤维素-O-（CH2）2-+N-α-、β-球蛋白pH6.3α-、β-球蛋白HC2H5NH2+H3PO4醋酸纤维素薄膜电泳法——鉴定γ-球蛋白纯化度用上述方法分离得的γ-球蛋白，是否纯净、单一可将纯化的后的γ-球蛋白进行电泳比较面鉴定之。[主要仪器及器材]离心机、层析柱(1X25cm附乳胶管及止水夹)、恒流泵电泳仅及电冰槽染色缸其他(试管、离心管、量筒、滴管、吸量管、烧杯、镊子等。)[试剂]1．饱和硫酸铵溶液：称固体硫酸铵(分析纯)850g，

6、置于1000ml蒸馏水中，在70—80℃水浴中搅拌溶解，将酸度调节至pH7.2。室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。2．葡聚糖凝胶G—50的处理：按每100：l凝胶床体积需要葡聚糖凝胶G—50(干胶)25g。称取所需量后置于锥形瓶中．每克干胶加入蒸馏水约30ml，用玻璃棒轻轻温匀，置于90—100℃水溶中时时搅动，使气泡逸出。1h后取出，稍静置，倾去上清液细粒。(也可于室温中浸泡24h，搅拌后稍静置，倾去上清液细粒．)用蒸馏水洗涤2、3次，然后加0.017mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，备用。3．

7、DEAE—32(二乙基氨基乙基—32)纤维素的处理：按100ml柱床体积需DEAE纤维素14g称取，每克0.5mol／l盐酸溶液15ml，搅拌；放置30min(盐酸处理时间不可大长，否则：DEAE纤维素变质)．加约10倍量的蒸馏水搅拌，放置片刻；待纤维素下沉后，倾弃含细微悬浮物的上层液。如此反复数次。静置30min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，直至上清液pH>4为止。加等体积1mol／L氢氧化钠溶液，使最终浓度约为0.5mol／L氢氧化钠，搅拌后放置30min，以虹吸除去上层液体。同上用蒸馏水反复洗至pH<7为止。虹吸去

8、除上层液体；然后加入0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(PH6.3)平衡，备用.4．A液：0.0175mol／L磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H20)2.730g溶于蒸馏水中，加蒸留水稀释至1000ml.B液：0.0175mol／L磷酸氢二钠(Na