血清γ-球蛋白的分离、纯化(实验六)

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1、血清γ－球蛋白的分离、纯化实验原理1.了解并初步掌握盐析法分离、纯化蛋白质的原理。2.熟悉盐析法分离、纯化蛋白质的方法。实验原理（一）蛋白质盐析在水溶液中，蛋白质分子由于表面生成水化层和同性电荷层而成为稳定的亲水胶体颗粒，因此蛋白质在水溶液中比较稳定而不易沉淀。当加入较高浓度的中性盐时，这些盐类与水有亲和性，与蛋白质争夺水分，破坏蛋白质颗粒表面的水化膜。同时，由于这些盐是强电解质，离子浓度相对的比较高，可以大量中和蛋白质颗粒上的电荷，这样使蛋白质成了既不含水膜又不带电荷的不稳定颗粒而容易沉淀，这就是利用盐析沉淀蛋白质的基本原理。

2、由于血清中各种蛋白质所带电荷多少、颗粒大小及亲水程度都不一样，因此使用某种中性盐进行盐析时，所需要的盐浓度也各不相同。50%饱和度的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而33％饱和度的硫酸铵则使γ-球蛋白沉淀。可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析。（二）浓缩一般实验室常用的是透析袋（半透膜）浓缩。半透膜具有选择透过性，只允许离子和小分子扩散进出，生物大分子（蛋白质等）不能自由通过半透膜。将待浓缩的蛋白质溶液放入透析袋内，用绳子扎紧，然后置于烧杯中。实验试剂与器材试剂：(1)小牛血清(2)PBS（pH7.2磷酸盐缓

3、冲生理盐水）(3)3%BaCl2溶液(4)pH7.2饱和硫酸胺溶液器材：(1)离心管(2)离心机(3)移液管(4)透析袋实验步骤（一）盐析——中性盐沉淀离心管加入血清2ml+2mlPBS摇匀逐滴加入pH7.2饱和硫酸胺溶液7ml边加边摇静置10min离心（3000转/分）10min弃上清液沉淀+1.0mlPBS使之溶解逐滴加饱和硫酸胺1.5ml摇匀静置10min离心（3000转/分）10min弃上清液沉淀（γ－球蛋白）（二）浓缩将上述收集的蛋白质+1mlPBS，沉淀完全溶解后，放入透析袋内，用绳子扎紧，然后置于100ml烧杯中，

4、加入纯净水。3~5min后，取1ml烧杯中溶液至试管中，再滴加BaCl2若出现白色混浊，将烧杯中的水倒掉，再换上纯净水。直至滴加BaCl2溶液不再出现白色混浊为止。注意事项1.在盐析时，饱和硫酸铵应逐滴加入，速度不能过快，一定要边滴加边搅拌，以减少局部高浓度硫酸铵所引起的共沉现象，搅拌速度不宜过快，以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。2.硫酸铵浓度越高越容易沉淀。但浓度过高容易引起其他杂蛋白的共沉作用，因此必须根据分离蛋白的浓度要求，控制适当的蛋白质浓度。3.离心时应平衡放置离心管。4.浓缩时，滴加BaCl2前，先取出透析袋再滴加

5、。5.更换蒸馏水的目的，是为了增大半透膜两边的浓度差。思考题1.为何硫酸胺能沉淀蛋白质?第一次盐析时硫酸胺的饱和度是多少?沉淀的是何种蛋白质，使沉淀溶解再次盐析的目的是什么?2.用硫酸胺分段沉淀蛋白质时，透析袋外液体会出现蛋白质吗?你能否做一个小实验加以证实，并说明实验原理。