实验六 血清γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定 - 青岛大学.ppt

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1、血清γ－球蛋白的分离、纯化及鉴定分工合作专人、固定锥形瓶，放开，不断滴加pH6.3醋酸盐缓冲液，防止气泡。盐析混匀时需要两个人合作。两次操作是一样的，都有动手的机会。改错！（P46页错误）操作一、盐析<1>取1ml血清1ml，<2>取1ml饱和(NH４)２SO４溶液缓慢滴入，边加边摇。<3>混匀后于室温中放置10分钟。目的要求(一)掌握分离纯化蛋白质的基本原理。(二)了解柱层析技术。实验原理蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。不同蛋白质的分子量、溶解度及在一定条件下，带电的情况等都有所不同。利用这些性质的差

2、别，可分离纯化各种蛋白质。一、粗提（盐析法）盐析的定义。常用的中性盐有：硫酸铵、硫酸钠等，由于各种蛋白质分子的颗粒大小和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。因此，调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。血清中含有清蛋白和球蛋白。用半饱和的(NH４)２SO４盐析可使球蛋白沉淀，而清蛋白仍留在溶液中，经离心而分离。原因：一、清蛋白等电点是4.0。α2球蛋白等电点是5.06，β球蛋白等电点是5.1，γ球蛋白等电点是7.1。二、清蛋白的分子量远小于球蛋白二、脱盐（凝胶层析法）盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐

3、后才能进一步纯化。脱盐有多种方法，本实验采用凝胶层析法。凝胶层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，各分子的扩散移动速度不同，使混合物质得到分离的技术。凝胶有多种，葡聚糖凝胶是最常用的一种人工合成凝胶。混合物中各种物质同时进行着两种不同的运动，垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质(蛋白质)直径大不能入凝胶颗粒的网孔，垂直向下的速度较快。小分子物质(无机盐)可扩散入凝胶颗粒网孔之中，结果小分子物质流出所经的路程较大分子为长，从而使混合物中各组分按分子大小不同的顺序流出，得到除去盐的蛋白质

4、溶液。三、纯化（离子交换法）离子交换是指溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称阳离子交换剂。DEAE纤维素是一种阴离子交换剂。因球蛋白中α及β球蛋白的pI＜6.3而γ球蛋白的pI＞6.3(pI7.3)故经DEAE纤维素阴离子交换层析流出的第一部分蛋白质为纯化的γ球蛋白。纯化前后的γ球蛋白用电泳法进行鉴定。操作一、盐析<1>取1ml血清1ml，<2>取1ml饱和(NH４)２SO４溶液缓慢滴入，边加边摇。<3>混匀后于室温中放置10分钟。<4>然后每分3500转离心10分钟，并

5、小心吸去上清液，用滤纸条吸除上清夜。<5>沉淀加pH6.5醋酸氨缓冲液0.5ml，使之溶解，作为纯化γ球蛋白用。二、G－25凝胶层析脱盐（一）葡聚糖凝胶G－25层析柱的制备：1、取层析柱，关紧下端出口加蒸馏水少许。2、缓慢加入膨胀处理过的凝胶悬液，预先经pH6.5醋酸盐缓冲液流洗平衡。3、待胶下沉至10～15cm高(防止凝胶分层和柱内混有气泡，使表面整平并盖一滤纸片，即可使用。（二）上样与洗脱：1、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面(注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气进行凝胶床)。2、关紧下端出口，用滴管吸

6、取盐析球蛋白液，小心缓慢的加到凝胶床表面上(注意不要将凝胶粒中冲起或破坏凝胶床表面的平整)。3、开下端出口，使样品进入凝胶床，关闭出口，小心加入适量pH6.3磷酸缓冲液。4、放开，流速约20滴/分钟，立即检测（方法见后），检测到蛋白后收集三管，20滴/管。颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。洗脱液中蛋白质的检查取小试管3个，分别加20％磺基水杨酸10滴，从下端管口取1滴，滴于试管中，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出。对比法：与未加液体的管对比，出现浑浊即开始收集。三、阴离子交换层析经处理再生后的DEAE－纤维素，将脱盐后含球蛋白

7、的溶液加于DEAE纤维阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱，分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集三管，20滴/管，编号。五、注意事项1、盐析：边加边混（为什么？）。2、滴速：20滴/分。3、避免污染磺基水杨酸。下午浓缩刷一个干净的小试管，滤纸上控干。找一张干净的纸条，折叠，倒入一包葡聚糖干粉，小心的送入试管底部。加入1号管的样品，小心的震荡混匀，取上层液体一滴上样。如果液体太少，小心的滴加2号试管的液体，混匀，取上清夜点样。回收！四、醋酸纤维素薄膜电泳检查样品：(1)血清。(2)纯化的γ－球蛋白液(由于此溶液浓度较低，应多次点样于同一位

8、置（10次），每次点样时待干后再点。注意事项1、不要调电泳仪！！！2、血清接触过的点样器、玻片用完后抛入84消毒液30分钟后清洗3、多次点样在同一位置！1、所用缓冲液为醋酸铵缓冲液，还是硫酸铵？2、完全饱和的硫酸铵中清蛋