血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定试验用

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1、血清白蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定目的要求(一)掌握分离纯化蛋白质的基本原理。(二)了解柱层析技术。（一）分离纯化的意义①从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。④基因工程的需要（二）分离纯化的要求1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要

2、求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。（三）分离纯化的一般程序生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段：①材料的选择和预处理②破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）③分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。选择材料破碎细胞提取分离纯化分析及鉴定常用的蛋白质分离纯化技术溶解度盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀分子大小透析、超过滤密度梯度离心、凝胶过滤带电特性电泳、

3、离子交换层析吸附特性吸附层析对配体分子的亲和性依据性质方法用于粗分用于细分亲和层析、金属螯合层析一、盐析（中性盐沉淀）在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。盐析法的优点：①成本低，不需要特别昂贵的设备。②操作简单、安全。③对许多生物活性物质具有稳定作用。盐析的基本原理蛋白质水溶胶的稳定因素：水化膜和电荷。中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。破坏水化膜，暴露出疏水区域，中和电荷，破坏亲水溶胶溶解度盐浓度Salting-outSalting-in++++++++++++++++等点电时的蛋白质（亲水

4、胶体）带负电荷蛋白质（亲水胶体）脱水脱水脱水带负电荷蛋白质（疏水胶体）不稳定蛋白颗粒阴离子阳离子碱酸酸蛋白质聚集沉淀带正电荷蛋白质（亲水胶体）碱++水化膜带正电荷蛋白质（疏水胶体）中性盐的选择常用的中性盐：(NH4)2SO41)溶解度大：0℃20℃80℃100℃（NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101硫酸铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类2)分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。3)不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用2

5、～3mol/L浓度的（NH4）2SO4保存可达数年之久。4)价格便宜，废液不污染环境。分段盐析不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%饱和度饱和析出析出1)清蛋白等电点是4.0，α2球蛋白等电点是5.06，β球蛋白等电点是5.1，γ球蛋白等电点是7.1。2)清蛋白的分子量远小于球蛋白色谱法chromatography脱盐和纯化——石油醚（流动相M）植物叶子的石油醚萃取液(样本)碳酸钙（固定相S）玻璃管（色谱柱）胡

6、萝卜素、叶黄素和叶绿素A、B连续色带（色谱）1906年俄国植物学家米哈伊尔.茨维特一．基本概念色谱法：利用混合物中各组分的理化性质的差异（吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、电荷等），使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相叫固定相，另一个相流过此固定相叫流动相。由于各组分受流动相作用产生的推力和受固定相作用产生的阻力不同，使各组分产生不同的移动速度，从而使结构上具有微小差异的各组分得到分离的过程，称之为色谱法。二．特点1、高效能2、高度选择性3、高灵敏度4、操作简单不足之处：定量精确，但定性较差色谱三、色谱的种类气相色谱液相色谱气－液色谱气－固色谱液－液色谱

7、液－固色谱1、吸附色谱法2、分配色谱法3、离子交换色谱法4、凝胶色谱法5、亲和色谱法按原理分类二、脱盐（凝胶层析法）透析——只用于除盐类和小分子杂质超过滤——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质加压蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液凝胶层析又叫分子筛层析。具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。常用分子筛：葡聚糖凝胶（Sephadex）型号：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15分离大蛋白质、小蛋白质，除盐琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国B