兔血清白蛋白及IgG分离纯化及鉴定

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1、兔血清白蛋白及IgG分离纯化及鉴定摘要：目的：以兔血清白蛋白和IgG的分离纯化与鉴定实验为例，阐述了血清蛋白制备与分析的过程。方法：使用了硫酸铁分级沉淀、凝胶过滤层析、DEAE离子交换层析、亲和层析、醋酸纤维薄膜电泳、SDS-PAGE.HPLC等分离纯化鉴定蛋白质的方法。结果：制备了兔血清白蛋白和Y—球蛋白(IgG),测定被分离物质的相对分子量，鉴定纯化产品的均一性。结论：该实验作为一门生物综合性大型实验，非常有利于培养学生掌握蛋白质制备与分析的综合技能。关键词：分离纯化；白蛋白；丫一球蛋白；实验中图分类号:Q5

2、03文献标识码：A文章编号：1008-2409(2007)03-0424-03血清白蛋白是人体内重要的营养物质，在血液中有重要生理功能，是血液总渗透压的主要调节物质，其浓度可以反映肝脏的功能，其水平的改变能导致一系列的病理性继发症。血清白蛋白的另一作用是作为脂肪酸的载体参与运送脂肪酸。此外，血清白蛋白还有重要的药用价值，注射白蛋白针剂可治疗浮肿等症。血清球蛋白是血清蛋白质的重要组成部分，能与外来的特异性抗原起免疫反应而保护机体。检查血清总蛋白及白、球蛋白的比值，即可了解肝脏受损害的程度。总蛋白下降、白/球蛋白比值

3、减少、电泳试验Y—球蛋白增加，是肝炎的常见情况。因此，测定血清白蛋白常用于患者状态的非特异监视。1材料与方法1.1材料试剂与仪器1.1.1材料兔血清。1.1.2试剂饱和(NH4)2S04溶液、磷酸盐缓冲液(pH6・3)、SephadexG—25、二乙氨乙基(DEAE)纤维素、三氯醋酸、0.5mol/L醋酸铁缓冲液(pH6・5)、0.06mool/L醋酸铁缓冲液(pH6・5)、0.02tool/L醋酸铁缓冲液(pH6・5)、SPA-Sepharose—4B>结合缓冲液(pH8.9)、缓冲液I(pH7.0的PBS)、

4、缓冲液I(pH3.0的PBS).Tris-Hcl缓冲液(pH8・5)、柠檬酸溶液(pH3・0)、0.9%NaCI溶液、标准血清白蛋白液、考马斯亮蓝G250等。1.1.3仪器层析柱，离心机，恒流泵，核酸蛋白检测仪，记录仪，电泳仪，垂直平板电泳槽，微量注射器，Agilent-1100-高效液相色谱仪、紫外可见分光光度计等。1.2方法1.2.1血清白蛋白的分离与纯化①硫酸鞍盐析法制备粗白蛋白液：取2.0ml兔血清于管中，逐滴加入饱和硫酸鞍溶液2.Omlo室温静置lOmin,3000r/min离心10mino移液枪小心吸

5、出上层清液作为纯化白蛋白之用。②凝胶柱层析获得除盐白蛋白液：SephadexG~25层析柱以0.02mol/L醋酸鞍缓冲液(pH6.5)平衡，以流速lml/min洗脱粗制白蛋白液获得除盐的白蛋白液。核酸蛋白检测仪在0.05A档、走纸速度6cm/h.100mV,同时记录吸光度值。③DEAE-纤维素离子交换层析柱分离白蛋白：装好的DEAE-纤维索离子交换层析柱以0.02mol/L醋酸鞍缓冲液(pH6.5)平衡，将去盐收集得的白蛋白液加到纤维素柱上，接上恒流泵，用0.06〜0.5mol/L醋酸铁缓冲液(pH6・5)以流

6、速为lml/min进行梯度洗脱。核酸蛋白检测仪在0.05A档、走纸速度6cm/h、100mV,同时记录吸光度值。1.2.2血清.Y-球蛋白的分离与纯化①硫酸铁盐析获得粗制丫-球蛋白液：取2.0ml兔血清于管中，逐滴加入饱和硫酸铁溶液2.Omlo室温静置10min,3000r/min离心10min,用移液枪小心吸出上层清液作为纯化白蛋白之用，沉淀用0.5ml的0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6・3)溶解作为纯化Y-球蛋白之用。②凝胶柱层析获得除盐粗制丫-球蛋白液：SephadexG-25层析柱经0.02mo

7、l/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)平衡后,0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6・3)以流速lml/min洗脱粗制丫-球蛋白液。核酸蛋白检测仪在0.05A档、走纸速度6cm/h、200mV,同时记录吸光度值。③DEAE-纤维素离子交换层析柱分离Y-球蛋白：将装好的DEAE-纤维素离子交换层析柱先经0.0175mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.3）平衡后，在纤维素床面上以流速为1ml/min的0.0175mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.3）进行洗脱。核酸蛋白检测仪在0.05A档、走纸速度6cm/h、100mV,同时

8、记录吸光度值。④亲和层析法纯化丫-球蛋白33：用恒流泵，以结合缓冲液平衡柱，流速为0.5ml/mino将DEAE-纤维素离子交换层析后的Y-球蛋白溶液上柱，用结合缓冲液洗柱。依次分别用5倍床体积的缓冲液I〜I洗脱（流速0.5ml/min）,缓冲液I洗脱IgGl,缓冲液I洗脱IgG2。每管中预先盛有lmol/LTris-Hcl缓冲液500ul,收集各吸收峰的蛋白液。透析除盐