血清球蛋白的分离纯化（纯化部分）课件

《血清球蛋白的分离纯化（纯化部分）课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、生化教研室血清γ-球蛋白的分离纯化——盐析、层析技术1.掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程2.熟悉盐析、离心、层析等生化基本技术在蛋白质分离纯化中的综合应用实验目的硫酸铵盐析初步分离γ-球蛋白盐析原理中性盐能破坏蛋白质溶液的水化膜,中和蛋白质的表面电荷,从而使蛋白质聚集沉淀分段盐析由于不同蛋白质分子颗粒大小、亲水程度、所带电荷的不同，盐析所需的盐浓度也是不同的。当调节不同的盐浓度，不同蛋白质将会分段沉淀，即分段盐析。50％饱和的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而33％饱和的硫酸铵则使γ-球蛋白沉淀。分离

2、γ-球蛋白理论依据实验试剂及器材离心管、离心机，滴管等血清，饱和硫酸铵溶液，PBS溶液等血清1ml(20d)饱和硫酸铵0.5ml(10d)G充分混匀离心5min4000rpmγ-G1.33%硫酸铵盐析分离γ-球蛋白2.γ-球蛋白溶液的制备PBS0.5ml(10d)（1）离心管要平衡对称；（2）离心机的启动、停止都要慢；（3）开始前，盖子盖紧；结束后，减速、关电源、自然停止。（4）过程中，若有异响，立即停止，检查离心管。离心机的使用方法及注意事项：二.凝胶层析纯化γ-球蛋白凝胶层析的定义又称凝胶过滤、分子筛

3、层析、排阻层析、凝胶渗透层析等凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。葡聚糖凝胶颗粒凝胶层析的原理物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向的扩散运动。被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的速度不同。实验器材及试剂器材层析柱，白瓷板，试管，滴管等试剂PBS缓冲液，双缩脲试剂、Nessler试剂等平衡上样洗脱清洗收集并检测凝胶层析脱盐凝胶处理装柱①自然溶涨法将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细

4、的小颗粒倾泻出去1.凝胶处理②加热法在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。2.装柱（1）装柱前准备:将层析柱下端的止水螺丝旋紧，往层析柱加入2-3ml洗脱液,以确保凝胶底部没有气泡。（2）装柱：把溶胀好的糊状凝胶边搅拌边倒入柱中，同时开启止水螺丝，控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在溶液中。最好一次连续装完，待凝胶装至10-15cm即可。注意防止气泡与分层,可用玻棒搅拌使表面平整。3.平衡通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，并始终保护凝胶上端

5、有一段液体。将柱中多余的液体从底部流出后关闭止水螺丝，取前面制备好的γ-球蛋白样品小心加到凝胶柱上，打开止水螺丝，使样品溶液流入柱内，当样品流至略高于柱床表面时，关闭止水螺丝。4.上样用缓冲液进行洗脱，控制缓冲液在约每5秒一滴的流速。5.洗脱收集洗脱液，每管收集12d，共收集12管，同时对收集液体进行检测。6.收集与检测蛋白质检测在各收集管中各取出1滴收集液滴于比色板孔中(按编号顺序)，加入1滴双缩脲试剂，观察并记录实验现象。从收集到的试管中取收集液1滴于比色板中，加入奈氏试剂1滴，观察并记录实验现象。N

6、H4+检测实验结果用洗脱液加满柱子，加快流速，清洗层析柱。清洗完毕后，保持胶面上方有4-5cm高度缓冲液，关闭止水螺丝。7.清洗