血清γ球蛋白的分离、纯化与鉴定的综合实验建立与探讨

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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果血清γ球蛋白的分离、纯化与鉴定的综合实验建立与探讨【关键词】综合实验生物化学γ球蛋白生物化学是研究生物体内化学分子与化学反应的科学，从分子水平探讨生命现象的本质［1］。生物化学基本理论的建立、完善和发展是以实验研究为基础［2］。而要完成开发学生的潜能，培养学生的创新精神和创新能力，培养大学生的综合素质这一任务的重要手段是在开设的综合实验中得以实现的［3］。我们依据

2、最新教学大纲，结合实验室现有的条件，对原有实验内容进行了重新整合，力争即有保留又有创新，设计了规模较大的综合实验“血清γ球蛋白的分离、纯化与鉴定”。经过反复实验预试，并经过一年医学本科学生的实验教学证明，实验方法稳定，结果重复可靠，便于学生操作，教学效果良好。1材料与方法仪器与材料仪器KDC40低速离心机、×20cm玻璃层析柱、722可见分光光度计、DYY2C电泳仪及DYCZ24D型垂直板电泳槽均为国产。试剂材料新鲜猪血清、饱和硫酸铵溶液、/L课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出

3、结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果PBS、葡聚糖凝胶G25、奈氏试剂、20%磺基水杨酸溶液、离子强度巴比妥缓冲液、氨基黑10B、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS考马斯亮蓝R250、甘氨酸、Tris、BSA等除SephadexG25(SWEDEN进口分装)外均为国产。方法取新鲜血清2ml，加入等量PBS和饱和硫酸铵溶液，混匀后静止3

4、0min，000rpm离心10min，沉淀物即是γ球蛋白。该步骤可重复12次，以保证纯度。将γ球蛋白通过SephadexG25层析作用，用PBS洗脱，除去蛋白质中的小分子铵盐，从而达到γ球蛋白纯化的目的。洗脱下来的收集液可以用磺基水杨酸检测蛋白质的存在，用奈氏试剂检测是否除净NH4+,然后把含有γ球蛋白的样品合并收集。把纯化的γ球蛋白与正常猪血清样品进行醋酸纤维素膜电泳作对照验证。把纯化的γ球蛋白、正常猪血清样品用双缩脉试剂显色后，用分光光度法测定其含量，并稀释成2mg/ml。把纯化

5、的γ球蛋白、正常猪血清及标准蛋白分别用含巯基乙醇的样品缓冲液处理，用12%分离胶进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)［4］，作进一步对照验证。结果.1醋酸纤维素膜电泳纯化的γ球蛋白样品为一条带；正常猪血清样品为五条带.2SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性

6、的成果正常猪血清样品出现十几条带，在清蛋白前面出现二条带且与纯化的γ球蛋白样品出现的二条带相平行。标准蛋白为纯一条带且与正常猪血清样品的清蛋白相平行，而纯化的γ球蛋白样品无明显清蛋白，其它蛋白带与正常猪血清样品相比较颜色对应变浅。讨论.1目的原理血清中的γ球蛋白是一类结构相似具有重要免疫功能的多种蛋白质，它们的分子量多数在150KDa左右，基本结构由两条分子量相同的轻链(Ｈ链23KDa)和两条分子量相同的重链(Ｌ链55KDa)通过二硫键连接组成。分离、纯化与鉴定γ球蛋白的方法很多，从设计的生

7、化实验目的考虑，选用硫酸铵盐析分离、葡聚糖凝胶纯化γ球蛋白，不仅保证其相对纯度，节省时间，更重要的是保证其完好的生物学活性。而用醋酸纤维素膜电泳和SDSPAGE，对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定，是较为经济、快速且可重复的方法，尤其是SDSPAGE，已成为许多研究领域广为应用的重要分析技术。课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提

8、出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果我们把纯化的γ球蛋白、正常猪血清及标准蛋白用含有巯基乙醇的样品缓冲液处理后进行SDSPAGE，可使纯化的γ球蛋白、正常猪血清中的γ球蛋白还原成两条分子量相同的轻链和两条分子量相同的重链而出现二条带，且相互平行；而标准蛋白不含二硫键，不能解链，故只出现一条带且与正常猪血清中的清蛋白相平行。至于纯化的γ球蛋白样品除γ球蛋白解链为重轻链后的其它蛋白在盐析时已分离出大部分，经高灵敏度的SDSPAGE仍可不同层度的显现出浅带