血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验报告

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1、南方医科女修生物化学实验报告姓名:学号:专业年级:组另IJ:生物化学与分子生物学实验教学中心南方医科女修生物化学实验报告姓名:学号:专业年级:组另IJ:生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称血清清蛋白、Y■球蛋白的分离、纯化与鉴定实验日期实验地点合作者指导老师评分XX教师签名李某某批改日期2013-06-03Roman；标题用:no四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字.英文用TimesNew现多行、多页空白现象。—、实验目的1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋口质的原

2、理和基本方法。2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。3、了解柱层析技术。二、实验原理1、粗提（盐析法）：蛋口质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。当维持蛋口质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷使蛋口质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于血清中各种蛋口质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同，因此，利用不同浓度的硫酸钱溶液分段盐析,便可将血清中清蛋口和球蛋口从溶液中沉淀岀来，达到初步分离清蛋白、球蛋

3、口的目的。2、脱盐（凝胶层析法）凝胶层析法利用蛋口质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过凝胶柱时，溶液中分子量较大的蛋口质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动,所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。而盐的分子量较小，可通过网孔进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。从而可达到去盐的目的。3、纯化（离子交换层析法）离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子

4、可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的pl各不相同，因此，在同一醋酸镀缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和丫■球蛋白分离出来。4、纯度鉴定（电泳）采用醋酸纤维素薄膜电泳对分离得到的清蛋白和Y■球蛋白进行纯度鉴定，以正常血清样品作对照。比较两者电泳图谱可定性判断纯化的清蛋白和Y■球蛋白的纯度。三、材料与方法：以流程图示意材料：1、样品：健康人血清（新鲜、无溶血、无沉淀物或细菌滋生）2、试剂：O.3

5、mol/L的PH6.5醋酸镀缓冲液、0.06mol/L的PH6.5醋酸鞍缓冲液＞0.02mol/L的PH6.5醋酸鞍缓冲液、1.5mol/L的NaCl-0.3mol/NH4Ac溶液、饱和硫酸镀溶液、0.92mol/L（20%）磺基水杨酸、0.05mol/L（1%）BaCl2溶液、氨基黑染色液、巴比妥缓冲液、漂洗液。3、仪器及器材：层析柱、烧杯、移液枪、加样枪、试管、滤纸、醋酸纤维素薄膜、黑色反应板、铁固定架、螺旋夹、离心管和离心机、培养皿、载玻片、滤纸、平头银子、电泳槽、直流稳压电泳仪。方法:粗提脫盐—>（盐析法）（凝胶层析法）纯化纯度鉴定—>取血清0

6、.8ml,边摇边缓慢滴加饱和硫酸钱溶液0.8ml,混匀室温放置lOmin,4000r/min离心lOmin沉淀（含球蛋白）加水0.6ml溶解过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0x7cm）上清液（含清蛋白、少量a球蛋白和B球蛋白）过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0x7cm）用lml0.02mol/LNJ^Ac缓冲液清洗层析柱内壁，继续用0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液（2ml）洗脱，流出液量约lml时开始检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质用lml0.02mol/LNH4Ac缓冲液清洗层析柱内壁，继续>ffl0.02mol/LpH6.5NH4Ac缓冲

7、液（2ml）洗脱，流出液量约lml时开始检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋口质收集含有蛋白质的峰液12d此吋磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性收集含有蛋白质的峰液12d此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性继续用2ml0.02mol/LNH4Ac缓冲液洗涤继续用2ml0.02mol/LNH4Ac缓冲液洗涤土卜fTTLVBaCb检测SO占阴性BaCb检测so/•阴性用2〜3ml0.02mol/LNH4AC缓冲液再生平衡用2〜3ml0.02mol/LNH4Ac缓冲液再生平衡（离子交换层析法）（电泳）VV离子交换柱层析纯化~>离子用1ml0.02mol/LN

8、H4Ac缓冲液清洗层析柱内壁，继续交用0.02mol/LpH6.5NH4Ac缓冲液（3ml）洗