血清清蛋白、γ-球蛋白地分离、纯化与鉴定实验报告材料

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1、实用标准文案生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心精彩文档实用标准文案实验名称血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验日期实验地点合作者指导老师评分XX教师签名李某某批改日期2013-06-03格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用TimesNewRoman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。一、实验目的1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。3、了解柱层析技术。二、实验原理1、粗提

2、（盐析法）：蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷使蛋白质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于血清中各种蛋白质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同，因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析，便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来，达到初步分离清蛋白、球蛋白的目的。2、脱盐（凝胶层析法）  精彩文档实用标准文案凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过凝胶柱

3、时，溶液中分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。而盐的分子量较小，可通过网孔进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。从而可达到去盐的目的。3、纯化（离子交换层析法）   离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。 脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利

4、用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的pI各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和γ-球蛋白分离出来。 4、纯度鉴定（电泳） 采用醋酸纤维素薄膜电泳对分离得到的清蛋白和γ-球蛋白进行纯度鉴定，以正常血清样品作对照。比较两者电泳图谱可定性判断纯化的清蛋白和γ-球蛋白的纯度。三、材料与方法：以流程图示意材料：1、样品：健康人血清（新鲜、无溶血、无沉淀物或细菌滋生）2、试剂：0.3mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.06mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.02mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、

5、1.5mol/L的NaCl-0.3mol/NH4Ac溶液、饱和硫酸铵溶液、0.92mol/L（20%）磺基水杨酸、0.05mol/L（1%）BaCl2溶液、氨基黑染色液、巴比妥缓冲液、漂洗液。3、精彩文档实用标准文案仪器及器材：层析柱、烧杯、移液枪、加样枪、试管、滤纸、醋酸纤维素薄膜、黑色反应板、铁固定架、螺旋夹、离心管和离心机、培养皿、载玻片、滤纸、平头镊子、电泳槽、直流稳压电泳仪。粗提脱盐纯化纯度鉴定（盐析法）（凝胶层析法）（离子交换层析法）（电泳）方法：离子交换柱层析纯化磺基水杨酸检测蛋白质此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性取血清0.8ml，边摇边缓慢滴加饱

6、和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min沉淀（含球蛋白）加水0.6ml溶解上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白)过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm）过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm）用1ml0.02mol/LNH4Ac缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/LpH6.5NH4Ac缓冲液(2ml)洗脱，流出液量约1ml时开始检测蛋白质用1ml0.02mol/LNH4Ac缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/LpH6.5NH4Ac缓冲液(2ml)洗脱，流出液量约1ml时开始检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质此

7、时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性盐析凝胶柱层系除盐继续用2ml0.02mol/LNH4Ac缓冲液洗涤收集含有蛋白质的峰液12dBaCl2检测SO42-阴性用2~3ml0.02mol/LNH4Ac缓冲液再生平衡继续用2ml0.02mol/LNH4Ac缓冲液洗涤用2~3ml0.02mol/LNH4Ac缓冲液再生平衡BaCl2检测SO42-阴性收集含有蛋白质的峰液12d精彩文档实用标准文案离子交换柱层纯化漂洗电泳准备将氨基黑染色液倒入培养皿中，用镊子取出薄膜浸入染液中，染色5min。除盐后收集的球蛋白用1ml0.02mol/