血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定-实验报告

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1、生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称(TitleofExperimetn)血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定实验日期(DateofExperiment)2013-12-11实验地点(LabNo.)合作者(Partner)指导老师(Instructor)总分(TotalScore)教师签名(Signature)批改日期(Date)     【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】实验目的：1、掌

2、握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5、了解柱层析技术实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。中性盐加入蛋白

3、质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。2、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。3、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。实验材料：人

4、混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液醋酸铵缓冲溶液20%磺基水杨酸1%BaCl2溶液氨基黑染色液漂洗液pH8.6巴比妥缓冲溶液电泳仪、电泳槽实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）实验步骤：（一）盐析+凝胶柱层析除盐：取血清0.8ml，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白)沉淀（含球蛋白）加水0.6ml溶解过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm）过葡聚糖凝胶G-2

5、5层析柱（1.0×7cm）用1ml0.02mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液洗脱，流出液量约1ml时开始检测蛋白质用1ml0.02mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液(2ml)洗脱，流出液量约1ml时开始检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液12滴收集含有蛋白质的峰液12滴继续用2ml0.02mol/LNH4AC缓冲液洗涤继续用2ml0.02mol/LNH4AC缓冲液洗涤BaCl2检测SO42-阴性BaCl2检测SO42-阴性用2-

6、3ml0.02mol/LNH4AC缓冲液再生平衡用2-3ml0.02mol/LNH4AC缓冲液再生平衡（一）离子交换层析（纯化）：除盐后收集的球蛋白过DEAE-纤维素层析柱（1.0×6cm）用1ml0.02mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液(3ml)洗脱，流出液量约1ml开始检测蛋白质取浓度最高的1管作纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的洗脱液每管10滴，连续收集3管除盐后收集的清蛋白过DEAE-纤维素层析柱（1.0×6cm）DEAE-纤维素柱不用再生，可直接用于纯化清蛋白用1ml0.0６m

7、ol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,用约５mL0.06mol/LNH4AC缓冲液流洗，除去α球蛋白和β球蛋白磺基水杨酸检测蛋白质收集含有清蛋白的洗脱液每管10滴，连续收集2管DEAE-纤维素柱先用6mll.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH4AC溶液流洗，再用10ml0.02mol/LNH4AC缓冲液流洗再生平衡2管均作纯度鉴定(醋酸纤维素薄膜电泳法)（三）醋酸纤维素薄膜电泳：1、点样（如下图）：-点样线+2cm点样区（粗面）1.5cm点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿