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《血清清蛋白与血浆γ-球蛋白的分离定量纯化和鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、实验设计班级：11级口腔木科2班姓名：段康博陈晓红章瑞雪郭昌再高原段康博学号：201150166201150167201150163201150145201150143【实验目的】1.了解并基本掌握蛋白质分离提纯的过程2.从血清中分离并纯化血清清蛋白和y■球蛋白。3.进行血清清蛋白和丫■球蛋白的定量和鉴定4.4.掌握电泳的原理方法及应用【实验原理】血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分，血浆蛋白质种类繁多，功能各异。川不同的分离方法可将血浆蛋白质分为不同的种类。在生物化学研究中，山于它们所带电荷不同、和
2、刈分子质量不同，在高浓度盐溶液中的溶解度不同，因此可利用它们在中性盐溶液中溶解度的差异而进行沉淀分离，用盐析法将血浆蛋白分为白蛋白（即清蛋白）、球蛋白与纤维蛋白原三大类。川盐析法分离而得的蛋白质含冇大量的硫酸鞍，会妨碍蛋白质的进一步纯化，因此必须去除，常用的侑透析法、凝胶过滤法等。木实验采用凝胶过滤法。脱盐后的蛋白质溶液再经DEAE纤维素层析柱进一步纯化。DEAE纤维素为阴离子交换剂，在pH6.5的条件下带冇正电荷，能吸附带负电荷的a-球蛋白和卜球蛋白（pl分别为4.9、5.06和5.12）,而匕
3、球蛋白（pl7.3）在此条件下带正电荷，不被吸附故直接从层析柱流出，此时收集的流出液即为纯化的L球蛋口。提高醋酸镀溶液的浓度到0.06mol/L,DEAE纤维索层析柱上的球蛋口及部分a・球蛋白可被洗脱下來。将酷酸鞍溶液的浓度提高至0.3mol/L,则清蛋口被洗脱下來,此时收集的流出液即为较纯的清蛋白。经DEAE纤维素阴离子交换柱纯化的清蛋白、丫一球蛋白液往往体积较大，样品质量分数较低。为便于鉴定，常需浓缩。浓缩的方法很多，本实验选用聚乙二醇透析浓缩的方法。血清清蛋口、严球蛋口分离纯化后，选用醋酸纤
4、维薄膜电泳法鉴定其纯度。然后，用酷酸纤维素薄膜电泳可分为五个区带，Y•球蛋白的等电点为7.3,在pH&6的巴比妥缓冲液中，带的负电荷最少，因此在电场中比其它蛋白质移动速度慢。而清蛋白等其它蛋白质的等电点均小于7.3（pl分别为4.9、5.06和5.12）,因此在电场中比冶球蛋白移动速度快。2s（此处插图）饱和度的硫酸狡溶液沉淀的球状蛋白质。血清白蛋白在血液中冇重要生理功能，和维持血液正常渗透压冇关，是血液总渗透压的主要调节物质。血清口蛋口的另一作用是作为脂肪酸的载体参与运送脂肪酸。Y-球蛋口乂称免
5、疫球蛋口，在血清蛋口质小数量居第三，具有重要的i用价值。【实验试剂与器材】试剂：(1)饱和硫酸鞍溶液：称取固体硫酸鞍850g加入lOOOmL蒸懾水中，在70-80°CH搅拌促熔，室温中放置过後，瓶底析出白色结品，上清液即为饱和硫酸镀液。(2)0.3mol/LpH6.5酷酸鞍缓冲液：称収酷酸鞍23.12g,加蒸谓水800mL,用稀氨水或稀醋酸调pH至6.5,定容至lOOOmLo(不得加热)(3)0.06mol/LpH6.5醋酸鞍缓冲液：取上液川蒸憎水稀释5倍。(4)0.02mol/LpH6.5醋酸钱
6、缓冲液：取上液川蒸僻水稀释3倍。(5)巴比妥缓冲液(pH8.6,离子强度0.06)：称取巴比妥纳12.76g,巴比妥1.66g,蒸镭水溶解并定容至1000mLo(6)染色液：氨基黑10B0.25g,用甲醇5()mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解。(7)漂洗液：甲醇或乙醇45niL,冰醋酸5mL,水50mL,混匀。(8)DEAE纤维素(9)新鲜血清(10)聚乙二醇(11)葡聚糖凝胶G・25(12)300g/L三氯乙酸器材：(13)纳氏试剂离心机和刻度离心管电泳仪电泳槽醋酸纤维膜pH试纸抽滤瓶黑、片
7、反丿应板透析袋铁架台滤纸点样器层析柱(1.5x20cm)吸量管银子微量加样器布氏漏斗培养皿【实验准备】DEAE纤维素处理：最取DEAE-纤维素20mL,加O.5mol/LHC1溶液50mL,搅拌后放置20min,川布氏漏斗抽干去除上清液，再用蒸镭水反复洗数次直至pH4.0为止。加等体积0.5mol/LNaOH溶液，搅拌后放置20min,虹吸去除上清液，同上用蒸镭水反复洗至pH<7为止。然后转移到烧杯内，加0.02mol/LpH6.5醋酸钱缓冲液40mL放置30min。待装柱。【实验步骤】分离和纯化
8、1•取刻度离心铮1支，加入l.OmL新鲜血清，边摇边缓慢滴入饱和硫酸钱液l.OmLo混匀后室温下放置10min,4000r/min离心10mino用滴管小心吸出上清液置于试管中，即为粗清蛋白液。2.离心管底部的沉淀加入0.8mL蒸饰水，振荡溶解，即为粗球蛋口液。3.凝胶的处理：量取30mL葡聚糖凝胶G-25G,加入2倍量的().02mol/LpH6.5醋酸钱缓冲液，置于沸水浴中lho取出冷却，待凝胶下沉后，倾去含冇细微悬浮物的上层液。4.装柱平衡：选用1.5x20cm层析柱，垂直夹
