海洋假交替单胞菌CI4菌株抗菌蛋白分离纯化的初步研究.pdf

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1、第25卷第2期2010年4月大连水产学院学报JOURNALOFDAUANFISHERIESUNIVERSITYV01．25No．2Apr．2010文章编号：1000-9957(2010)02一0097—05海洋假交替单胞菌C14菌株抗菌蛋白分离纯化的初步研究马悦欣，刘志明，刘鹏亮，曹善茂，张丽萍，谢淑瑾(大连水产学院农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室，辽宁大连116023)摘要：将海洋假交替单胞菌Pse舰nassp．C14菌株于VNSS液体培养基中培养，获得浓缩无细胞上清液，采用纸片扩散法检测其抗菌活性。结果表明，该菌株的胞外产物能够抑制从岩

2、石表面分离的污损细菌s1菌株和其自身的生长。除去菌体培养液，用饱和度为70％的硫酸铵沉淀，所得的拮抗物粗提液对热部分敏感，对蛋白酶K和链霉蛋白酶敏感，其作用的活性pH稳定范围为5．0-9．0。粗提液经SephadexG一200柱层析、DE一52纤维素离子交换柱层析，Microeon离心超滤管分级和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)跟踪检测，得到电泳纯抗菌蛋白，其相对分子质量为37200。关键词：假交替单胞菌C14菌株；抗菌蛋白；纯化中图分类号：Q938．1文献标志码：A海洋表面环境是微生物、固着动物和植物混合组成的生物污损群落建立的潜在场所

3、。通常这一过程是从细菌附着开始，然后是硅藻以及浮游生活的藻类孢子和无脊椎动物幼虫的附着¨≈J。细菌具有强烈影响其它附着生物在这种环境下建立的潜力。已有研究表明，海洋生物表面附着的假交替单胞菌属的多种菌可产生一系列具有生物活性的化合物【3J，其中研究的最为广泛的种类是从污损生物玻璃海鞘C／onaintestinalis和石莼Ulvalactuca表面分离的被囊假交替单胞菌Pseudoaltermonastunicata，该细菌能产生抑制细菌和真菌生长，阻止多种无脊椎动物幼体和藻类孢子附着的特异化合物HJ。从裸腮类动物Archidorispseud

4、oargus表面分离的假单胞菌PseudomonasNUDMB50—1l中提取的吩嗪一l一羧酸对污损细菌具有很强的抑制活性【4J。从海洋细菌——奥奈达湖西瓦氏菌ShewaneUaoneidensisSCH0402中提取的两种化合物能够排斥其它污损细菌垆J。笔者在以往的研究中发现，从玻璃海鞘成体表面分离出来的假交替单胞菌Pseudoaltermon．伽sp．C14菌株能够抑制污损细菌的生长∞o以及内刺盘管虫幼虫和石莼孢子的附着r71。本实验中，作者对该菌株的抗菌蛋白进行了分离纯化，旨在为明确该菌的防污机制提供一些参考依据。1材料与方法1．1材料1

5、．1．1菌株及培养条件拮抗菌株为大连水产学院农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室从玻璃海鞘表面分离的假交替单胞菌C14菌株，玻璃海鞘采自大连黑石礁海域海水养殖筏上的海湾扇贝养殖笼内的PVC隔板；指示菌株是从岩石表面分离的革兰氏阴性菌S1菌株和拈抗菌株本身。常规培养使用VNSS培养基【8J。1．1．2主要试剂和仪器DE一52纤维素、Sepha．dex—G200购自Pharmacia公司；SDS—PAGE分子量标准蛋白质购自BIO—RAD公司；考马斯亮蓝R一250购自BBI公司；THZ一25大容量恒温振荡器为太仓市华美生化仪器厂生产；层析系统为上海

6、沪西分析仪器厂有限公司生产；紫外分光光度计为上海光谱仪器有限公司生产。1．2假交替单胞菌C14菌株抗菌粗提液的制备将已活化的C14菌株接种于VNSS液体培养基中，25℃下震荡培养24h，于4℃下离心30min(×9000g)；收集细胞，以密度为0．3g／mL细菌收稿日期：2009—05—15基金项目：辽宁省自然科学基金资助项目(20062129)作者简介：马悦欣(1963一)，女，教授。E—mail：mayuexin@dlfu．edu．cn98大连水产学院学报第25卷重新悬浮于NSS中，25℃下静止培养24h后。于4℃下离心30min(×150

7、00g)；将上清液经过滤除菌后，加入固体(NH。)：SO。至其饱和度为70％，4℃下沉淀过夜，于次日离心30rain(4℃，×15000g)；弃上清液，将沉淀溶于适量的0．025mol／LTris—HCI缓冲溶液(pH8．0)中，并用这一缓冲液进行透析获得粗提液。用纸片法测定粗提液的抗菌活性一1，用紫外吸收法测定蛋白质含量¨0l，采用系列二倍稀释法测定抗菌活力的效价㈨。1．3粗提液稳定性的测定1．3．1温度对粗提液稳定性的影响将粗提液在不同温度下处理30rain，分别取20止处理液进行抗菌活性测定，以未作处理的粗提液的抑菌圈直径作为对照，其抑菌

8、活性设为100％。1．3．2pH对粗提液稳定性的影响将粗提液分别调至不同的pH值，于28℃下处理lh后调至原来的pH值，分别取20斗L处理液进行抗菌活